学术动态24一种新的支持乙肝病毒感染

摘要

目前，尚缺乏能够动态模拟乙肝病毒（hepatitisBvirus，HBV）从感染、复制、播散入血，进而感染肝脏其它肝细胞的实验感染系统。该文报导了韩国MarcPeterWindisch实验室建立的一种肝细胞来源的缓慢增殖HepG2-NTCP细胞株，通过接种来自患者或细胞培养的HBV病毒颗粒，该细胞株能够支持病毒从感染、复制到感染播散的整个过程。

在HBV传染性细胞模型建立过程中，作者从过表达HBV细胞膜受体钠离子／牛磺胆酸共转运蛋白（sodium-taurocholateco-transportspeptides，NTCP）的HepG2细胞系筛选到一株能产生高滴度感染性子代病毒的克隆细胞株（HepG2-NTCPsec+）。基于RNA-seq的转录组学结果显示，与HepG2-NTCPsec-细胞株相比，HBV使HepG2-NTCPsec+中利于HBV复制的转录因子的表达明显上调，但HepG2重要基因的表达无明显影响。用HBV感染者的血清处理HepG2-NTCPsec+细胞后，电镜观察发现，受感染的HepG2-NTCPsec+能够分泌、释放高水平的传染性子代病毒颗粒（即丹颗粒），病毒向邻近细胞传播，感染细胞的比率由最初的10%上升到70%。根据病毒来源不同，HepG2-NTCPsec+可支持高达倍的HBV基因组净扩增量。在该感染细胞模型中，加入病毒感染和复制的抑制剂能够有效抑制病毒的复制和播散，撤除抑制剂后能够观察到病毒的反弹。据此可以判定，该HepG2-NTCPsec+细胞能够有效支持HBV的完整生命周期，通过接种，可以使来自患者或培养细胞产生的乙肝病毒通过感染的方式长期传播和复制。该过程与HBV感染患者的病毒持续感染、复制的特征相类似，重现了HBV感染肝脏、传播并释放入血液持续感染的动态变化。这种新的感染模型可以通过预先测量患者的HBV病毒株对特定抗病毒药物的敏感性来改进治疗。

乙肝病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染有严格的宿主、组织特异性，既往只有高度分化的来自人或树鼩的肝细胞可用于体外HBV感染的研究，严重阻碍了HBV生命周期的研究和新治疗方法的发现。目前体外感染研究的金标准是使用原代人肝细胞（primaryhumanhepatocytes，PHHs）和患者来源的HBV。然而PHHs成本高、来源有限，且存在供体变异和去分化等缺点，限制了其应用。肝癌HepaRG细胞系只有中等程度的HBV易感性，且感染时需要诱导其重新分化。新的模型（取自人类肝脏组织）即自组装培养（SACC）非实质PHHs以及3D微流控PHHs系统，可在5-6周的时间窗口内支持来自细胞培养和纯化的患者来源的乙肝病毒的持续感染，但不支持病毒复制和产生有感染性的HBV颗粒。此外，诱导多能干细胞或胚胎干细胞定向分化的人肝细胞样细胞（hepatocytelikecell，HLC）易受HBV感染，并支持有限的病毒复制和播散。

HBV转基因肝癌细胞系如HepAD38和HepG2.2.15能够用于产生细胞来源的乙型肝炎病毒颗粒（cellculture-derivedHBV，HBVcc），肝癌细胞系如HepG2和Huh7细胞转染HBV质粒后可以支持HBV复制，但上述细胞系均不支持HBV感染。发现钠-牛磺胆酸盐共转运多肽（sodium-taurocholateco-transportspeptides，NTCP）这一分化依赖的肝细胞和种群特异性的HBV细胞膜受体是一项重大突破，实现了HBV的体外感染，但感染效率低。为提高HBV感染效率，往往在细胞培养基中添加聚乙二醇（PEG）以增加病毒吸附和进入；添加二甲基亚砜（DMSO）来减缓细胞增殖、提高分化状态、延长细胞寿命，以增强易感性和HBV复制。然而这些细胞在HBV感染和游离cccDNA形成后，产生的子代病毒不能有效地在细胞间传播。

该项研究筛选并鉴定了一种缓慢增殖的HepG2-NTCP细胞株，该细胞株能够在培养细胞和患者来源的HBV感染后产生大量感染性子代病毒，作者还基于此研究了HBV长期感染增殖下的动态和路径。

01

HepG2-NTCPsec+细胞株的构建和鉴定

为筛选鉴定一种HBV易感的、能产生强传染性HBV子代病毒的HepG2-NTCP细胞克隆，通过添加筛选药物Blasticidin6周，从亲本HepG2-NTCP细胞选择出5个新的、NTCP过表达的HepG2-NTCP克隆。以亲代细胞克隆和另一个已发表的HepG2-NTCP（sec-）克隆作为对照，HBV易感性的检测显示，仅3号细胞株NTCP表达弱。为了检测不同克隆的传染性子代HBV的产生情况，作者用连续稀释的HBV感染p1代细胞，将上清液传代至p2细胞进行感染。根据接种量的不同，p1感染率在10%~90%不等，以5号细胞株2代细胞感染的效率最高，能达到50%。随即将5号细胞株作为筛选出的细胞株，并命名为HepG2-NTCPsec+。为进一步确证上述连续感染实验，作者在1代细胞培养基中添加拉米夫定（lamivudine，LMV）能够阻断1代细胞感染后的上清液对2代细胞的感染，进一步明确2代细胞感染并非由原代接种病毒感染所致（Fig1A~E）。

Fig1.筛选分泌传染性子代HBV的HepG2-NTCP克隆。（A）HBV感染流程。（B）NTCP（上图，绿色）和加或不加MyrB处理HBcAg（中、下图，绿色）特异性免疫荧光。细胞核（蓝色）。（C）1代细胞产毒感染2代细胞实验示意图。（D）定量检测HBV感染p1和p2HepG2-NTCP细胞。（E）HBcAg特异性免疫荧光分析p1和p2代HepG2-NTCPsec-细胞和mock、10μMLAM处理的HepG2-NTCPsec+。每张图像显示平均HBV感染率（%）。

02

HepG2-NTCPsec+产生的子代HBV的鉴定

通过对比接种了高剂量HBVcc的HepG2-NTCPsec+和HepG2-NTCPsec-细胞株的HBV感染率、病毒抗原表达和培养上清中的HBVDNA水平，作者发现，在4周后有两个细胞克隆感染细胞占比都能达到90%（Fig2A）。此时，HepG2-NTCPsec+分泌的HBeAg和HBsAg分别是HepG2-NTCPsec-的3倍和16倍（Fig2B）。同时，HepG2-NTCPsec+也产生了更多的HBVDNA（Fig2B）。Westernblot显示，HepG2-NTCPsec-仅能产生低水平的L-HBs和HBcAg（Fig2C）。与此相反，HepG2-NTCPsec+分泌的包膜病毒颗粒数量不断增加（Fig2C）。整合了病毒DNA的HepAD38细胞分泌的非感染性“裸”衣壳是其分泌的带有L-HBs包膜的病毒颗粒的10倍（Fig2C）；相比于HBV感染的HepG2-NTCPsec-和HBV复制细胞模型HepAD38细胞，HepG2-NTCPsec+分泌的L-HBs包裹的HBV颗粒更多，约是其倍左右且没有裸衣壳（Fig2D）。故HepG2-NTCPsec+产生的子代病毒颗粒较HepAD38细胞更具感染性（Fig2E）。负染电镜观察，HepG2-NTCPsec+感染病毒后除了产生丹颗粒外，也能观察到典型的球状和丝状亚病毒颗粒（Fig2F）。

Fig2.HepG2-NTCPsec+释放的子代HBV的感染性与HBsAg包膜、核衣壳有关。（A）HBV感染的1~4代HepG2-NTCPsec-/sec+细胞HBcAg特异性的免疫荧光分析和核染色。（B）ELISA和qPCR分析HBV感染的HepG2-NTCPsec-/sec+细胞分泌的HBeAg水平（左）、HBsAg水平（中）、HBV基因组水平（右）。（C）westernblot实验采用L-HBs及HBcAg分析培养上清中有包膜的HBV颗粒（）和裸衣壳的。每10μL上清液显示HBV基因组数。（D）CHB患者血清中HBV颗粒的组成模式。（E）HepG2-NTCPsec+（7dpi）细胞接种HepAD38或HepG2-NTCPsec+产生的HBV感染比例。（F）负染色电镜观察感染后HepG2-NTCPsec+产生HBV颗粒形态。

03

HepG2-NTCPsec+和HepG2-NTCPsec-的转录组学比较

为了解HepG2-NTCPsec+与sec-细胞产生的子代HBV存在显著差别的原因，作者比较了两者感染前后的转录组差异（Fig3A）。结果发现，HBV感染的HepG2-NTCPsec+和sec-细胞共有个基因存在显著的表达差异（sec+上调，下调），基因功能富集分析发现这些差异基因多为与HBV进入、转录、装配和释放相关的宿主因子（Fig3B）。如，HepG2-NTCPsec+细胞中NTCP在mRNA和蛋白水平均高于sec-细胞；而和HBV吸附相关的基因如HSPG、AGRN、GPC和SDC等在HepG2-NTCPsec-细胞中表达更高（Fig3C）。相比与sec-细胞，在HepG2-NTCPsec+细胞中CEBPA，FXR，PPARA，PPARGC1A/B和PPARG等11种已报道的HBV转录因子有2~倍的表达升高。preS1依赖的病毒包膜相关的基因和ESCRT0复合物相关基因等都是sec+细胞中高表达，只有HNF1B相比于sec-细胞有5倍的下降（Fig3D）。DDX3X和DDX3Y为两种能够抑制HBV复制的RNA解旋酶，其在HepG2-NTCPsec-中有2~6倍的高表达。同样，HBV限制性宿主因子APOBEC3G在sec+细胞中有4倍的高表达。

Fig3.比较HepG2-NTCPsec+和HepG2-NTCPsec-的转录组学。从HepG2-NTCPsec+/sec-和HBV感染的HepG2-NTCPsec+/sec-分离总RNA。构建了一个包含个基因的cDNA文库，并对其进行了测序。（A）差异表达基因散点图。HepG2-NTCPsec+w/oHBV与sec+HBV（左）或HepG2-NTCPsec-w/oHBV与sec-HBV（右）。（B）在HepG2-NTCPsec+HBV与HepG2-NTCPsec-HBV差异表达基因散点图。（C-D）与HBV进入（C）或转录（D）相关的基因表达的Log2倍变化，HepG2-NTCPsec+HBVVS.HepG2-NTCPsec-HBV。

04

HepG2-NTCPsec+支持子代HBV再感染播散、HBV复制和cccDNA池补充

作者动态监测了HepG2-NTCPsec+细胞在HBV病毒感染后的长期（6周）感染率（Fig4A）。接种后1周时的染率约为30%，之后稳定增加，到4-5周时达到80%的平台期（Fig4B）。拉米夫定（LAM）能够阻断感染播散，表明病毒播散由细胞产生的子代病毒导致，而不是添加的原病毒。抗-HBs抗体同样能够阻断病毒传播，这表明病毒通过释放到细胞外子代病毒传播，而不是细胞间的直接传递。此外，HBV的传播还能够被肝素、MyrB和抗-preS1抗体以剂量依赖形式阻断（Fig4C）。

在持续感染过程中，新的cccDNA可由胞外病毒颗粒从头再感染或新合成的含rcDNA的核心颗粒进入细胞核转化生成。LMV阻断pgRNA逆转录产生rcDNA，能阻止这两种途径的cccDNA池的补充（Fig4D）。但进入抑制剂抑制cccDNA形成的现象则表明，新的cccDNA主要来自从头感染的病毒颗粒（Fig4E）。作者估计，在此体外细胞感染系统中细胞外病毒再感染途径占新合成cccDNA生成的88%，细胞内循环补充途径不超过12%。HBV分泌能够被抗-HBs抗体和LMV剂量依赖性地阻断，在LMV停药1-2周后细胞即可发生HBV病毒的再分泌（Fig4F）。

Fig4.HepG2-NTCPsec+细胞中的cccDNA池主要是通过细胞外病毒再感染和细胞内循环途径补充。（A）HBVcc感染HepG2-NTCPsec+流程示意图。细胞分别接受mock、LMV、或抗-HBs、抗-LHBs、肝素、MyrB处理6周。（B）免疫荧光分析观察HBV感染细胞HBcAg的表达情况。（C）抗S-HBs、抗L-HBs（）、MyrB和肝素对HBV传播的剂量依赖性抑制。（D）HBVcccDNA和rcDNA的Southernblot，并对各自的条带进行半定量分析。（E）用qPCR定量分析cccDNA。（F）用qPCR定量分析分泌的HBV基因组。

05

子代HBV播散倾向于临近细胞

使用专业图像分析软件分析全孔HBcAg荧光图片的方法能够评估感染细胞间的距离，并观察HBV感染的细胞簇的形成。结果显示HBV感染细胞簇随时间扩大，病毒进入抑制剂MyrB和抗-HBs抗体能够阻断大细胞簇的形成。该结果提示HBV播散可能倾向于在临近细胞间发生。为了更加直观地看到单个细胞水平的病毒传播，作者设计了如下实验：将感染HBV的HepG2-NTCPsec+细胞与未感染HepG2-NTCPsec+细胞共培养1周，感染后的细胞能够标记上绿色荧光，未感染的细胞提前标记了红色荧光（RFP）。当未感染细胞感染后，同时表达两种荧光，表现为黄色荧光。结果显示，黄色荧光细胞多数出现在表达绿色荧光的细胞周围，即新感染的细胞大多出现在原先被感染的细胞周围，表明病毒传播遵循临近细胞间的传播途径。MyrB和LMV能够减少HBV播散至未感染细胞，感染率约减少6倍。

Fig5.HBV播散感染邻近的HepG2-NTCPsec+细胞。（D）荧光标记研究HBV传播途径实验示意图。（E）加或不加抗-HBs时（）感染的RFP报告细胞（黄色）和未感染的RFP报告细胞（红色）及HBVcc感染的HepG2-NTCPsec+（绿色）的高倍放大图像。

06

HepG2-NTCPsec+细胞支持患者血清来源HBV持续复制和播散

上述结果已证实HepG2-NTCPsec+细胞支持HBVcc的传播。作者进一步探究该细胞能否支持病人来源的HBV（patient-derivedHBV，HBVpt）的传播。用来自7例不同病毒载量及不同HBeAg状态的韩国CHB患者的血清感染sec+细胞后，免疫荧光法检测HBc表达的结果显示，7例样本中的4例导致了2倍cut-off值（1%感染细胞）以上的细胞感染（#1、#2、#3、#6），显示出感染建立成功，且细胞感染率与接种的病毒量成正比。高病毒载量的#1和#2患者血清在感染细胞1周后分别有47%和56%的细胞被感染。在病毒低载量的#6患者血清处理后仅有零星的细胞被感染。#4和#5患者未建立感染，结合#6患者结果，作者大致评估了建立感染的最小剂量可能为2×~3×GEq/mL。而#7患者尽管病毒载量较高却未造成有效感染。但延长观察时间至8周时，作者在#4、#5和#7患者血清处理的细胞中也分别观察到有2%、16%和5%的细胞感染率。

Fig6.乙型肝炎病毒C基因型临床标本对HepG2-NTCPsec+的感染性。（A）测序证实7例患者血清的基因型、病毒基因组载量和HBsAg水平、每纳克病毒基因组HBs比例和HBeAg状态。（B）用7例CHB患者的血清连续稀释感染细胞。通过免疫荧光分析患者1号在7dpi时的HBcAg和HBsAg。（C）对7例患者血清处理1wpi时HBcAg阳性细胞的定量。

对患者血清处理后细胞培养上清的HBV的抗原和DNA水平的连续检测发现，可能是由于新感染细胞产生病毒和蛋白不如接种病毒多，病毒标志物与基线相比在第一周出现了下降。HBsAg在感染1-3周之后下降。但在7或8周时，伴随着病毒传播带来的HBV感染细胞数增加，HBVDNA会出现从6×到5×GEq/mL的增加，HBsAg也从0.1ng/mL增加至ng/mL。

为评估患者来源的HBV毒株对抗病毒治疗的敏感性，作者将0.6μL的#1患者的血清接种到HepG2-NTCPsec+细胞中，以建立一个极低的初始感染率。HBVDNA和HBsAg在感染4周后分泌增多，8周后达到接种量的50倍。伴随着感染细胞的增加HBcAg免疫荧光阳性的细胞数也增加。在此系统中加入抗-HBs和抗-preS1抗体，以及病毒进入细胞抑制剂MyrB均能够阻止新感染细胞的增加和病毒标志物的产生。

总结

与转染超基因组大小的肝癌细胞相比，HepG2-NTCPsec+细胞在电子显微镜下观察到产生真正有包膜的传染性HBV颗粒。同时，也使针对cccDNA表观遗传调控的研究成为可能。该模型还可以用于比较不同HBV变异株的特性，研究抑制剂停用后病毒的反弹动力学和耐药突变病毒准种在抗病毒治疗压力下的进化等等。在临床上，该模型同样也有潜在的应用前景：其能够使用少量患者血清扩增分离临床分离株，以研究其传染性、复制效率和抗病毒治疗的敏感性等。该模型还可以用于研究HBV形态发生的基础分子生物学，包括包膜形成、分泌途径和传播等。

文献来源：

K?nigA,YangJ,JoE,etal.Efficientlong-termamplificationofhepatitisBvirusisolatesafterinfectionofslowproliferatingHepG2-NTCPcells.JHepatol.;71(2):–.

文字：高林

编辑：杨兴雯

校对：彭思雯、闫颖

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