学术动态16丨慢乙肝患者HBcAg与

摘要

乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝DNA病毒，可导致肝硬化和肝癌等病理改变。在慢性HBV感染中，适应性免疫的抗原特异性T/B淋巴细胞在人体中协同对抗病原体，因受到不同调节的影响，其功能在持续感染期间会出现改变。各种HBV蛋白特异性的T细胞在慢性HBV感染患者中均表达较少，并表现出功能缺陷，而针对不同病毒蛋白组分的特异性体液免疫受抑制情况则不尽相同。如病毒包膜主要成分（HBsAg）的特异性抗体（抗-HBs）在慢性HBV感染患者中产生的数量非常少，仅在HBV感染已治愈的受试者中可检测到。相比之下，针对核衣壳蛋白组分（HBcAg）的特异性抗体不仅在自限性感染和慢性HBV感染患者中均可检测到，并且在后者中更为丰富。既往研究已证明慢性HBV感染患者会持续产生抗-HBc。小鼠实验表明产生抗-HBc的浆细胞发育是一个非T细胞依赖的过程，但HBsAg-和HBcAg-特异性B细胞对抗原持续存在产生的不同应答的原因尚不清楚。

本文作者通过用DyLight或DyLight标记的重组HBsAg或HBcAg蛋白标记HBsAg-和HBcAg-特异性B细胞，研究为何持续存在的HBcAg诱发抗-HBc的产生，而不是耐受。结果显示，慢性HBV感染者中，HBcAg-特异性B细胞的出现频率高于HBsAg-特异性B细胞。与HBsAg-特异性B细胞不同，HBcAg-特异性B细胞在体外能有效地成熟为抗体分泌细胞，表型和转录组特征表明其主要为IgG+记忆B细胞。来自慢性HBV感染患者的HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞尽管在表型和功能上存在差异，但其mRNA表达模式均不同于全体记忆B细胞，其特征是抗原交叉呈递和固有免疫活动基因的高表达。

01HBV感染状态下HBcAg-特异性B细胞的频率

用HBcAg-D/D和HBsAg-D/D同时检测了27位慢性HBV感染者和八例已治愈患者外周血中HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞的数量（图1A），在27位患者中的26位均检测到更多的HBcAg-特异性B细胞，其数量是HBsAg-特异性B细胞的5.3倍。慢性HBV感染患者的HBcAg-特异性B细胞占全部B细胞的比值在0.03%-1.2%之间（图1A，表1）。在已治愈（抗-HBs+，抗-HBc+）的受试者中，循环血液中HBcAg-特异性B细胞数量比慢性HBV感染患者少（15倍），水平也低于HBsAg-特异性B细胞（图1B，1C）。慢性HBV感染患者HBcAg-特异性B细胞的中位数在e抗原（HBeAg）阴性和阳性的慢性HBV感染患者中差异不大（图1C）。此外作者还注意到，血清中HBsAg、HBV-DNA和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平与HBcAg-特异性B细胞的表达水平没有统计学相关性(图1D)。然而，对4位肝炎暴发的慢性HBV感染患者的HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞水平的纵向分析表明，只有HBcAg-特异性B细胞在肝炎暴发时被暂时扩增，这与肝炎暴发期间乙型肝炎核心抗原相关抗原（HBcrAg）水平的增加一致（图1E）。

图1慢性HBV感染患者HBcAg-特异性B细胞的表达水平比HBsAg-特异性B细胞高。

（A）27例慢性HBV感染患者和（B）8例已治愈受试者CD19+细胞中HBcAg-与HBsAg-特异性B细胞占比的比较，流式细胞结果来自其中一位受试者。（C）10例HBeAg+慢性HBV感染患者、25例HBeAg-慢性HBV感染患者和8例已治愈受试者的CD19+细胞中HBcAg-特异性B细胞占比。（D）HBcAg-特异性B细胞的表达水平与年龄、HBsAg、HBV-DNA、ALT水平无关。（E）4例慢性HBV感染肝炎爆发患者HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞表达水平和血清ALT水平的纵向分析。

表1本研究中慢性HBV感染患者和已治愈受试者的详细信息

02HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞在慢性HBV感染患者中的功能比较分析

高剂量的抗原暴露和肝细胞介导的呈递可能是HBs-特异性B细胞在慢性HBV感染患者中功能下降的原因。在慢性HBV感染患者中,高滴度的抗-HBc表明HBc-特异性B细胞功能良好，然而在体外HBc-特异性B细胞是否能发育为产生抗体的细胞尚不清楚。为了分析这种潜在的可能性，作者从6例慢性HBV感染患者中平行分选HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞，并将相同数量的HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞与表达CD40L的成纤维细胞共培养，加入IL-2（一种在免疫应答中发挥重要作用的细胞因子，可以激活细胞免疫和体液免疫）和IL-21（由滤泡中的Th细胞为主活化的CD4+T细胞分泌，能调节、维持固有免疫和适应性免疫中T、B细胞的功能）进行刺激，以检测它们发育为产生抗体的B细胞的能力（图2A为实验流程）。图3展示了同一患者的HBcAg-特异性B细胞与HBsAg-特异性B细胞的两种完全不同的功能成熟方向。结果显示，HBsAg-特异性B细胞在体外不会扩增、成熟，而HBcAg-特异性B细胞可以发育成为产生抗-HBc的B细胞（图2B,2C）。重要的是，当固有免疫刺激CpG触发抗体产生时，这种区别仍然存在。

图2HBcAg-特异性B细胞可分化为产生抗体的细胞，而HBsAg-特异性B细胞存在功能缺陷。

（A）实验方法流程示意图。对相同数量的HBcAg-或HBsAg-特异的B细胞进行分选、扩增和分析，ELISA和ELISpot检测特异性抗体的产生。（B）利用抗-HBc和抗-HBs的效价(bar)及B细胞扩增后的相应ELISpot结果来表征每个慢性HBV感染患者分选的B细胞数量。（C）慢性HBV感染患者(n=6)分选的HBcAg-和HBsAg-特异性记忆B细胞（MBCs）及健康疫苗接种者(n=8)分选的HBsAg-特异性MBCs的抗-HBc和抗-HBs斑点数统计结果。

03慢性HBV感染患者HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞的表型和基因表达不同

对慢性HBV感染患者B细胞的表型分析显示CD21-CD27-的非典型记忆(AtM)B细胞的数量增加，在HBsAg-特异性B细胞群中尤为明显。与功能失调的HBsAg特异性B细胞相比，慢性HBV感染患者的HBcAg特异性B细胞是高效的抗体分泌细胞。为探究这些功能上的差异是否会反映在其表型上，使用13色抗体组合对来自慢性HBV感染患者的PBMCs进行了染色和流式细胞术分析。结果显示，几乎所有的HBcAg-特异性B细胞都是IgG+的典型MBCs（图3B），而来自慢性HBV感染患者的HBsAg-特异性B细胞则富含AtMB细胞（图3B，3C，3D）。HBcAg-特异性B细胞主要是IgG+，而HBsAg-特异性B细胞以IgM+为主，这与HBsAg-特异性B细胞抗原亲和力更低是一致的（图3E）。此外，与HBsAg-特异性B细胞相比，同一患者HBcAg-特异性B细胞的活化分子CD95表达水平更高，调节受体IL10Rα表达水平更低，而活化分子CD38和CD69则无差异（图3F）。

图3与富含AtMB细胞的HBsAg-特异性B细胞不同，HBcAg-特异性B细胞以典型的IgG+MBCs为主。

（A）来自健康疫苗接种者（HCvac，n=5）和慢性HBV感染患者(n=8)的MBCs的级联流式细胞术数据的UMAP图。根据表达热点图(右侧面板)描绘MBC亚群(左侧)。（B）将HBcAg-（左）和HBsAg-特异性B细胞（中：慢性HBV感染,n=8；右：HCvac，n=5）重叠在全体MBCUMAP图上。（C）HBV-特异性B细胞中的AtMB细胞（CD21-CD27-）。对慢性HBV感染患者HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞中（D）AtMB细胞，（E）IgG+(左)，IgM+(右)，（F）CD95+(左)，IL10R+(右)的数量分别进行配对分析。

由于慢性HBV感染患者HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞在数量、表型和功能上均存在差异。为探究背后的机制，作者对11例ALT水平正常（以排除炎症引起的转录变化）的慢性HBV感染患者的HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞进行平行分选，并比较它们的转录谱。在检测限以上的个基因中，只有34个有显著差异表达（图4A）。与其IgG+表型一致，HBcAg-特异性B细胞中控制类别转换重组的CD99、IL6R、CXCR3和BATF表达更高，CD24表达更低，这提示它们具备分化为浆细胞的能力。此外，与HBsAg-特异性B细胞相比，HBcAg-特异性B细胞的TGFB1表达水平更高，而TGFB1在控制体液反应和IgA类群转换中非常重要。相反，HBsAg-特异性B细胞中，血小板内皮细胞粘附分子（PECAM1/CD31）的表达增加了6.6倍，这是一种跨膜分子，已被证明在维持B细胞的耐受性中发挥作用（图4B，4C）。不仅如此，NFATC1（调节B细胞的稳态和凋亡）在HBsAg-特异性B细胞中也有所上调。与其IgM+、IgD+表型一致，HBsAg-特异性B细胞表达了高水平的BCR-信号分子PTK2和SYK，并且由于TNFRSF13B(TACI)表达水平的增加，表现与边缘区样B细胞（marginalzone-likeBcells,一种会自我更新的B细胞）相似。

图4慢性HBV感染患者HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞的转录表达差异对来自11位慢性HBV感染患者的HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞进行平行分选。

（A）热图显示了HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞间差异表达的34个基因的相对mRNA表达水平。（B）火山图显示了HBcAg-特异性B细胞vs.HBsAg-特异性B细胞基线基因表达差异的p值(-log10)和fold-change(log2)。（C）同一位慢性HBV感染患者的HBcAg-特异性B细胞vs.HBsAg-特异性B细胞差异基因配对分析。

04慢性HBV感染患者中HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞与总记忆性B细胞亚群的基因表达比较分析

为了进一步研究慢HBV感染患者具有异质性的HBV-特异性B细胞和全体MBCs的差异，作者对7位ALT正常的慢性HBV感染患者的HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞的基因表达谱与3个全体MBCs亚群的基因表达谱进行了比较，并发现存在根本性差异（图5A）。与总MBCs相比，在检测限以上的个基因中有个基因在HBcAg-特异性B细胞中存在表达差异，个基因在HBsAg-特异性B细胞中存在表达差异。然而绝大多数(个)的差异表达基因是两种HBV-特异性B细胞共有的（图5B）。需要注意的是，这两种类型的HBV-特异性B细胞与有交叉呈递作用的树突状细胞募集相关的基因(XCL1和CD40LG)表达均增加。此外，HBV-特异性B细胞中，与固有免疫激活相关的基因(MYD88,IFNA1/13,IFNA2,IFNB1)和支持其在肝脏缺氧环境中迁移和代谢功能的分子(IL7R,ARG2)的表达同样有所增强。

图5慢性HBV感染患者的HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞的有着相似的转录组特征，但与全体MBCs存在差异。根据CD21和CD27的表达水平对5-7例慢性HBV感染患者的3个记忆B细胞群(静息状态[RM]、激活状态[AM]、非典型MBCs[AtM])进行分选。对11例慢性HBV感染患者的HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞进行平行分选。

（A）热图显示了上述背景中所有个基因的相对表达水平。（B）维恩图显示了在全体MBCs和HBV-特异性B细胞（黑色：HBsAg和HBcAg；浅蓝：只有HBcAg；深蓝只有HBsAg）之间差异表达的基因数量。（C）火山图显示了HBcAg-特异性B细胞vs.MBCs基线（左）以及HBsAg-特异性B细胞vs.MBCs基线（右）基因差异经过Bonferroni校正的p值(-log10)和fold-change(log2)。

讨论

在慢性HBV感染期间，患者血清可检测到针对HBcAg的抗体，而无法检测到针对HBsAg的抗体。该研究结果显示，与HBsAg-特异性B细胞不同，慢性HBV感染者中的HBcAg-特异性B细胞出现的频率更高，而且会发育成熟为产生抗-HBc的浆细胞。作者认为这种不同类型的HBV-特异性B细胞存在功能差异最可能的原因是，HBcAg无需辅助性T细胞的存在便可激活B细胞并促其成熟，并且持续刺激的HBcAg抗原数量低于HBsAg。

慢性HBV感染患者血液中存在高浓度的由包膜蛋白构成的空病毒颗粒。此外，HBsAg还能以被抗-HBs抗体识别的形式存在于肝细胞表面。相比之下，可用于与HBcAg-特异性B细胞相互作用的HBcAg数量较少，肝细胞的HBcAg优先定位于胞内(细胞核和细胞质)，裸露的HBV核心颗粒由感染肝细胞产生和分泌，但其数量只占HBV感染期间所有包膜颗粒的极小部分。因此，HBcAg与其特异性B细胞的相互作用可能仅限于肝炎症性坏死事件中由死亡肝细胞分泌或释放的裸核颗粒上。这可能解释了为什么我们观察到在慢性HBV感染肝炎爆发期间，HBcAg-特异性B细胞出现频率与HBcrAg水平相关。

与其功能状态上的差异一致，慢性HBV感染患者HBsAg-和HBcAg-特异性B细胞在转录组水平存在差异。CD31/PECAM1、NFTAC1等与B细胞发育调控相关的基因在HBsAg-特异性B细胞中表达上调和IL6R和CXCR3在HBcAg-特异性B细胞中表达上调的结果证实，HBsAg-特异性B细胞存在成熟缺陷，而HBcAg-特异性B细胞具有记忆细胞样的功能。

对于该研究可能的不足，作者认为文中使用荧光染料标记HBcAg-和HBsAg-特异性B细胞时，可能存在标记物与BCR结合，激活固有免疫基因表达的情况，造成结果不准确的可能性，因此慢性HBV感染患者HBV-特异性细胞固有免疫基因的激活情况仍需要进一步验证。

文献来源：

LeBertN,SalimzadehL,GillUS,etal.ComparativecharacterizationofBcellsspecificforHBVnucleocapsidandenvelopeproteinsinpatientswithchronichepatitisB.JHepatol.;72(1):34–44.doi:10./j.jhep..07.

文字：李德瑶

排版：杨兴雯

校对：曾婉嘉高林

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