乙型肝炎母婴传播对HBcAg细胞免疫应答

摘要

该研究在乙型肝炎病毒（HBV）携带儿童和HBV携带母亲所生新生儿中进行了针对HBcAg特异的细胞免疫研究。研究发现，在谷丙转氨酶（ALT）水平升高的10名儿童中，5名儿童的外周血单个核细胞（PBMCs）对HBcAg应答有显著增殖反应，但在ALT水平正常的9名HBeAg阳性儿童中无此现象。在HBeAg阳性母亲所生的10例新生儿中，9例脐血中检测到了HBeAg，但未检测到HBsAg，该结果表明这些新生儿在宫内暴露于HBeAg。但是，HBeAg阳性母亲所生新生儿的脐血单个核细胞中，抑制性和辅助性T细胞亚群的比例或对HBcAg应答的增殖反应没有明显的影响；与HBcAg共培养后，它们也不产生白介素2受体。同时，CD8+T细胞去除实验并不能逆转PBMCs或脐血单个核细胞对HBcAg的无反应性。尽管抗-HBe（anti-HBe）阳性母亲所生的新生儿脐血单个核细胞也对HBcAg无反应，但该研究中有一例抗-HBe阳性母亲所生的婴儿在2.5个月大时发生了急性肝炎，其PBMCs对HBcAg表现出了明显的增殖反应。上述结果表明，胎盘中母体来源的HBeAg可能在HBeAg阳性母亲所生新生儿体内诱导辅助性T细胞对HBcAg和HBeAg特异性无应答，这种特定的辅助性T细胞耐受在携带状态的整个早期阶段维持，但当ALT水平升高时可能会被打破。

乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染的结局取决于宿主免疫和病毒之间的相互作用。乙型肝炎e抗原（hepatitisBeantigen，HBeAg）阳性母亲所生新生儿围生期暴露于HBV通常会导致慢性携带状态。尽管通常认为这是由于新生儿免疫系统的不成熟，但确切的机制仍尚待进一步研究确定。小鼠实验表明，乙型肝炎核心抗原（hepatitisBcoreantigen，HBcAg）和HBeAg在T细胞中具有高度的交叉免疫原性。同时，HBcAg和HBeAg被认为是慢性HBV感染中引起细胞毒性T淋巴细胞杀伤感染肝细胞的主要靶标蛋白，可介导对HBV感染肝细胞的清除。血清HBeAg阳性的女性携带者在妊娠期间，IgG结合的HBeAg可通过胎盘进入胎儿体内。Thomas等学者认为胎盘中的HBeAg可能通过抗原特异性抑制性T细胞（suppressorTcell，一种CD8+的、具有抑制性的T细胞）抑制宿主的免疫应答，诱导新生儿对HBV产生免疫耐受。Milich等人的实验证明，表达HBeAg的转基因小鼠体内HBe/HBc特异性T细胞对HBeAg、HBcAg和p-完全无应答，因此他们认为HBe/HBc特异性辅助性T细胞（helperTcell，Th）耐受可能是HBeAg阳性母亲所生新生儿免疫缺陷的原因。由于将HBeAg或HBcAg注射到新生儿体内是违背伦理学的，因此该实验不能在人群中进行重复。

为了检验这些可能的假说，这篇发表于年的研究尝试通过检测HBeAg阳性母所生新生儿脐带血细胞对重组HBcAg（rHBcAg）的细胞免疫应答，以期了解经胎盘进入胎儿体内的HBeAg对HBc/HBe特异性T细胞功能的影响。此外，通过比较乙型肝炎e抗体（anti-hepatitisBeantigen，anti-HBe）阳性母亲所生的发生急性乙型肝炎的婴儿体内和慢性HBV携带的儿童体内免疫细胞对rHBcAg的增殖反应，该研究尝试将rHBcAg诱导的T细胞应答与慢性携带者状态或围生期HBV传播后发生急性肝炎中观察到的血清学和生化事件联系起来。

儿童外周血单个核细胞对于rHBcAg的增殖反应

该研究队列纳入26名儿童（组1）和30名新生儿（组2）。其中，组1a纳入10名HBsAg携带儿童（9名男孩，1名女孩），其ALT水平高于正常水平（99~IU/L）；组1b纳入10名ALT水平正常的HBsAg携带儿童（8名男孩，2名女孩）；组1c由6名健康儿童组成（4名男孩，2名女孩）。组2a包括10名健康母亲所生的新生儿，组2b包含10名HBsAg阳性而HBeAg阴性母亲所生的新生儿，组2c包含10名HBsAg、HBeAg双阳性母亲所生的新生儿。此外，有1例抗-HBe阳性母亲所生的女性婴儿在2.5个月大时发生了急性肝炎，也纳入了研究。

研究首先使用组1a的样本进行淋巴细胞增殖实验的刺激剂量摸索，10人中仅有5人产生了显著的增殖反应（SI＞2，表1）。使用这5例样本进行rHBcAg刺激剂量-应答曲线绘制（图1），最终选择4个浓度（0.5、0.1、0.05及0.01μg/mL）进行后续的增殖实验。

图1不同剂量下外周血单个核细胞对于rHBcAg的增殖应答情况

如表1所示，组1a中5例应答样本中，3例来自携带母亲所生儿童，这提示HBV感染主要发生于围生期传播。此外，淋巴细胞增殖反应与ALT水平无明显相关性。在组1b和组1c中均未观察到明显的增殖反应。为进一步探究是否由于HBcAg特异性抑制导致了免疫细胞无应答，该研究组使用磁珠负性筛选去除了组1a及组1b中4名携带者样本单个核细胞中的CD8+细胞，再次进行了淋巴细胞增殖实验。如表1所示，CD8+细胞去除后同样不能出现细胞增殖应答。而发生急性肝炎的婴儿外周血单个核细胞对rHBcAg的刺激产生了显著的淋巴细胞增殖应答，且当CD8+细胞去除后淋巴细胞增殖反应增强（图2）。这可能是由于CD4+细胞的增加或抑制性CD8+细胞的减少导致的。

图2急性肝炎患者样本外周血单个核细胞淋巴细胞增殖应答结果

表1HBV携带儿童临床特征及淋巴细胞增殖应答情况

新生儿脐血血清学和T细胞亚群分析

对组2各样本血清进行了检测，其中组2c的10例脐血中9例检测HBeAg为阳性，组2a及2b血清样本均为HBeAg阴性，所有脐血样本HBsAg均为阴性。三组脐血样本中各淋巴细胞亚群所占百分比无明显差异。

丝裂原及rHBcAg刺激脐血单个核细胞增殖应答及IL-2受体产生情况

对组2中三组脐血单个核细胞使用丝裂原（PHA、ConA及PWM）诱导的淋巴细胞增殖应答无明显差异。与预期一致，组2a及组2b对于4种浓度的rHBcAg刺激均无显著增值应答。而组2c尽管在宫内暴露过HBeAg，其脐血中单个核细胞对于rHBcAg刺激完全无应答（表2）。同样，去除CD8+细胞后再次进行实验，PHA刺激下细胞出现了轻微的增加，而rHBcAg刺激仍无效果（表3）。

在2μg/mL的PHA刺激后，IL-2R在三组脐血单个核细胞中的表达情况相似，依次为组2a：±U/mL、组2b：±U/mL及组2c：±U/mL。三组样本在rHBcAg刺激后的IL-2R表达情况均低于检测下限。

表2PHA及rHBcAg刺激后新生儿脐血单个核细胞增殖应答情况

表3CD8+细胞去除前后PHA及rHBcAg刺激新生儿脐血单个核细胞增殖应答情况比较

讨论

该研究探索了经胎盘传递的HBeAg对于新生儿HBc/HBe特异性T细胞功能的影响。由于在孕期对胎儿循环血中的HBeAg检测是违背伦理的，同时存在母血污染胎血样本的可能，该研究及其他研究通过对脐血的检测完成探索，同样可作为强有力的证据证明母体HBeAg可穿过胎盘使婴儿发生宫内HBeAg暴露。该研究在HBeAg阳性母亲所生的10例新生儿脐血中检测到9例HBeAg阳性但HBsAg阴性，证明了HBeAg主要经胎盘进入了胎儿的血液循环。HBeAg阳性携带者血液中的HBeAg主要有两种存在形式——游离的HBeAg小分子和IgG结合的HBeAg大分子。Arakawa等学者发现脐血血清中仅可检测到IgG结合的HBeAg，而胎盘滋养层细胞表面表达IgG受体，因此IgG的运输可由受体介导的经典内吞过程完成。综上，这些证据链证明新生儿的免疫细胞在宫内即发生了HBeAg暴露。

脐血淋巴细胞亚群分析结果显示，HBeAg宫内暴露后抑制性和Th细胞亚群的比例无明显改变。脐血单个核细胞中T淋巴细胞IL-2R或HLA-DR的表达缺乏提示HBeAg宫内暴露未活化T细胞。但由于抗原刺激后T淋巴细胞表达IL-2R或HLA-DR是一个短暂的时相，也可能是未在最佳时间检测导致了目前这一结果。

同时，该研究发现，抗-HBe阳性及HBeAg阳性母亲所生新生儿的脐血单个核细胞对rHBcAg均无增殖应答。尽管如此，HBeAg阳性的母亲所生的新生儿大多数均发展为慢性携带者；相反，抗-HBe阳性母亲所生婴儿几乎不发生感染。这可能反映了这两组新生儿发生感染时不同的免疫状态。抗-HBe阳性母亲所生新生儿未在宫内直接暴露于HBeAg，故对于rHBcAg无应答。而当出生后6周到6个月时，T细胞逐渐对HBe/HBc抗原表位敏感，从而清除感染的肝细胞，导致急肝炎并引起HBcAg特异性淋巴细胞增殖，正如该研究中观察到的那一例2.5月龄婴儿的表现；同样，在两项独立的成年人急性肝炎研究中也观察到了显著的HBcAg特异性T细胞应答。相反，HBeAg阳性母亲所生新生儿在宫内就暴露于HBeAg，导致了HBe/HBc特异性T细胞的免疫耐受，在围生期感染HBV后无法对HBe/HBc表位肽段产生应答，从而导致了无症状的慢性携带状态。

此外，抗原特异性抑制性T细胞可能是导致免疫耐受的另一个原因。但该研究中，去除所有CD8+细胞后依旧对rHBcAg无应答的结果并不支持这一观点。因此，脐血单个核细胞对于rHBcAg的无应答可能主要是由于CD4+细胞缺乏识别这种抗原的能力。与该观点一致，有小鼠实验也表明，宫内未成熟的免疫细胞长期暴露于HBeAg可能导致子代HBe/HBc特异性Th细胞功能缺失。

理论上，出生后由母体进入新生儿体内的HBeAg会在一段时间内消失。然而，在围生期感染HBV的新生儿通常发展为慢性携带状态，并且在出生后2~3月龄时产生HBsAg及HBeAg，导致出生后一年内循环中HBe/HBc特异性Th细胞免疫耐受；在这一HBV复制期，儿童携带者通常无临床症状、ALT水平正常或接近正常同时HBeAg阳性。这与该研究在ALT水平正常儿童携带者中发现单个核细胞无应答结果一致。

HBe/HBc特异性Th细胞免疫耐受可能在多年后被打破，例如3位ALT水平升高的携带状态儿童体内淋巴细胞对rHBcAg产生了应答。在慢性HBV感染中，ALT水平升高通常反映了肝细胞损伤并与T细胞对HBeAg、HBcAg应答相关。打破Th细胞免疫耐受的原因仍不清楚，可能机制十分复杂。一种解释认为前核心区域的突变导致循环血中HBeAg的减少，可能导致了HBV无应答状态的逐渐改变。此外，随着年龄增长，患者免疫系统的完全成熟及HBcAg在感染肝细胞中由胞核向胞浆迁移导致细胞毒性T细胞更易活化，可能导致了慢性HBV感染者由免疫耐受期进展为免疫清除期，最终导致大多数感染肝细胞的清除。

文献来源：HYHsu,MHChang,KHHsieh,etal.CellularImmuneResponsetoHBcAginMother-To-InfantTransmissionofHepatitisBVirus.Hepatology.May;15(5):-6.doi:10./hep..

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