学术动态26丨外泌体介导乙型肝炎病毒

摘要

有证据表明外泌体可以在细胞之间转移遗传物质。但它们在乙型肝炎病毒（HBV）感染中的作用仍不清楚。该文报道了慢性乙型肝炎（CHB）患者血清中不仅存在含有HBV核酸和HBV蛋白的外泌体，这些外泌体还能活跃地将HBV转移至肝细胞。体外实验观察到，来自CHB患者和健康供体的自然杀伤（NK）细胞暴露于HBV阳性外泌体后，这些细胞中都检测到了HBV核酸。通过实时荧光显微镜和流式细胞术，观察到细胞膜荧光探针DiD标记的外泌体与NK细胞相互作用，并被NK细胞摄取。这种作用可通过转化生长因子-β的处理得到增强。此外，HBV阳性外泌体还可损害NK细胞功能，包括干扰素（IFN）-γ的产生、溶细胞活性、NK细胞增殖和存活以及细胞对聚肌胞苷酸（poly(I:C)）刺激的反应能力。HBV感染抑制了NK细胞上的模式识别受体，特别是维甲酸诱导基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）的表达，从而抑制了核因子κB（NF-κB）和p38丝裂原活化蛋白激酶途径。

外泌体是源自多囊泡体（MVB）的细胞外囊泡的亚群，多囊泡体是一种晚期内体，大小约30-nm。目前有研究表明，外泌体介导HCV的细胞间传播并存在潜在的免疫逃逸或反应机制。有研究报道IFN-α诱导的抗病毒反应可以通过外泌体从肝非实质细胞传递到HBV感染的肝细胞，从而恢复了肝细胞的抗病毒状态。关于在HBV感染过程中，感染肝细胞产生的外泌体是否介导HBV的传播，目前尚不清楚。此外，慢性乙肝（CHB）患者的NK细胞功能在HBV持续感染期间受到干扰，表现出较低的溶细胞活性和IFN-γ分泌，可推测HBV可能通过外泌体损害NK细胞功能。

01

CHB患者的外泌体含有HBV成分

为了研究CHB患者血清中的外泌体介导HBV传播的能力，采用CD63免疫磁珠分离法从CHB患者血清中纯化外泌体。透射电子显微镜显示这些外泌体囊泡大小约为50-nm（图1a）。此外，这些外泌体也表达另一种外泌体标志物CD81（图1b）。为了阐明这些外泌体是否包含HBV成分，分别检测了来自CHB患者血清的外泌体中是否存在HBVDNA和HBVRNA（图1c）以及HBsAg（图1d）。以上实验结果表明，CHB患者血清中存在的外泌体含有HBV核酸和HBV蛋白。

图1.CHB患者的外泌体含有病毒成分。

（a）CHB患者血清中纯化的外泌体的电子显微镜图像。比例尺，nm。（b）用CD81蛋白通过流式细胞术鉴定从CHB患者血清中分离的外泌体。阴影直方图代表同型对照。（c）使用PCR和RT-PCR分别检测从CHB患者血清中分离的外泌体中的HBVDNA（rcDNA和cccDNA）和HBVRNA（HBx和HBs/p）。（d）对健康供体（HD）和CHB患者血清外泌体中HBsAg和CD63的蛋白质印迹分析（10μg/孔）。

02

外泌体可将HBV传递给未感染的肝癌细胞

为了解CHB患者的外泌体是否可以将HBV传递给未感染的肝细胞，将CFSE标记的人肝癌细胞系HLCZ01与用DiD标记的外泌体进行共孵育，并使用实时荧光显微镜技术来追踪外泌体进入HLCZ01细胞的过程。结果表明，外泌体在培养基中快速自由移动。同时，外泌体倾向于附着并进入HLCZ01细胞（图2a）。免疫荧光法也证实了HLCZ01细胞摄取外泌体。如图2b所示，与活细胞不同，低聚甲醛固定的细胞不能摄取DiD标记的外泌体，证实肝细胞对外泌体的摄取是一个主动的过程。此外，暴露于HBV阳性外泌体2天后，通过免疫组织化学分析显示HLCZ01细胞中HBsAg和HBcAg呈阳性（图2c），且这些抗原水平、HBV病毒载量和经HepG2.2.15细胞上清液处理的HLCZ01细胞的水平相当（图2d）。以上结果表明，外泌体将HBV传递给肝细胞的能力与游离病毒颗粒一样有效。

图2.外泌体可以将HBV传递给未感染的肝癌细胞。

（a）共聚焦图像显示CFSE标记的HLCZ01细胞（绿色）与DiD标记的外泌体（红色）共孵育2h的共定位情况。比例尺：20μm。（b）比较活的HLCZ01细胞和固定后的HLCZ01细胞摄取细胞膜荧光探针DiD标记的外泌体（红色）的能力。比例尺：20μm。（c）用CHB患者外泌体或HepG2.2.15上清液感染的HLCZ01细胞中HBsAg和HBcAg蛋白的免疫组织化学染色。（d）用HD或CHB患者的外泌体、HepG2细胞上清液或HepG2.2.15细胞上清液处理的HLCZ01细胞中HBVDNA的定量PCR分析，感染复数为50（n=3）。HepG2和HepG2.2.15细胞分别作为阴性和阳性对照。结果代表至少三个独立的实验。数据表示为平均值±标准误。*P＜0.05，**P＜0.01。GS：HepG2上清液；2.15S：HepG2.2.15上清液。

03

CHB患者的外泌体可导致NK细胞功能障碍

在没有预先刺激的情况下，NK细胞是外周血单个核细胞（PBMC）中的主要的溶细胞效应细胞。与先前的报道相似，作者观察到，与健康供体NK细胞介导的细胞毒作用相比，CHB患者NK细胞介导的针对K细胞的细胞毒作用受到了抑制（图3a），同时伴随着脱颗粒分子CDa（图3b）和IFN-γ表达的减少（图3c），表明HBV感染抑制了NK细胞功能。为进一步研究外泌体是否介导了HBV对NK细胞功能的干扰。将健康供体的原代NK细胞与CHB患者的外泌体共孵育2天后，这些NK细胞介导的细胞毒性、CDa、IFN-γ和肿瘤坏死因子（TNF）-α的产生显著低于与健康志愿者的外泌体共孵育的NK细胞（图3d和e）。与之一致，CHB患者来源的外泌体显著降低了NK细胞上激活性受体NKp44的表达，而抑制性受体NKG2A的表达则上调（图3f）。这些数据表明，CHB患者的外泌体可以导致NK细胞的功能障碍。

图3.CHB患者的外泌体影响NK细胞功能。

（a）使用MTT法来确定NK细胞介导的针对K细胞的细胞毒效应。使用流式细胞仪分析了CD56+CD3-NK细胞中CDa（b）和IFN-γ（c）的产生。（d）用HD或CHB患者的外泌体（5或10μg/ml）处理HD的NK细胞。然后通过CFSE/7AAD分析其对K细胞的细胞毒作用（左），通过流式细胞术检测CDa的产生（右）。（e）按d的处理，通过流式细胞术检测NK细胞产生的IFN-γ和TNF-α。（f）通过FACS分析确定用CHB外泌体（10μg/ml）处理后的NK细胞上激活性受体和抑制性受体的表达。

04

外泌体可将HBV传递到NK细胞

随后，为了阐明CHB患者的外泌体是否通过将HBV传递给NK细胞进而干扰NK细胞功能，作者首先分析了CHB患者的原代NK细胞中HBVDNA和HBVRNA的存在情况。如图4a所示，使用PCR或RT-PCR，在这些NK细胞中观察到HBVrcDNA和HBVRNA（HBx和HBs/p），但未观察到cccDNA。同时，电子显微镜下还观察到CHB患者NK细胞的细胞质中存在病毒包涵体样颗粒（图4b）。根据所有白细胞亚群都能够摄取肿瘤细胞释放的外泌体的现象，作者将健康供体的NK细胞与CHB患者的外泌体共孵育，通过实时荧光显微镜（图4c）和流式细胞分析（图4d）发现，外泌体附着在NK细胞上随后进入NK细胞，这个过程受低温和孵育时间的影响。此外，转化生长因子β（TGF-β）处理后NK细胞的摄取能力显著提高（图4e）。如图4f所示，在暴露于HBV阳性外泌体的NK细胞中检测到HBVrcDNA和HBVRNA，这与CHB患者外周血NK细胞的观察结果一致（图4a）。这些发现表明，外泌体可以充当载体，将HBV成分递送到NK细胞中，且细胞因子可以调节该过程。

图4.HBV可通过外泌体传播到NK细胞中。

（a）鉴定HD和CHB患者NK细胞中的HBVDNA（rcDNA和cccDNA）和HBVRNA（HBx和HBs/p）。（b）使用超薄切片透射电子显微镜观察来自高病毒载量CHB患者新鲜分离的NK细胞。电子密度不规则的胞质包涵体显示在左图和中图（箭头所指处和环内）。比例尺：2μm和nm。（c）共聚焦图像显示CFSE标记的原代NK细胞（绿色）与细胞膜荧光探针DiD标记的外泌体（红色）一起孵育3h的共定位。比例尺：20μm。（d）通过流式细胞术确定在37或4℃下孵育12或24h后，原代NK细胞对DiD标记的外泌体的摄取。（e）TGF-β（5ng/ml）增强了原代NK细胞摄取DiD标记的外泌体的能力（红色）。（f）分析被CHB患者血清外泌体感染的HD原代NK细胞中的HBVDNA（rcDNA和cccDNA）和RNA（HBx和HBs/p）。

05

HBV组分抑制NK细胞功能和细胞活力

为了确认HBV组分是否能直接干扰NK细胞功能，用pLMP-HBV质粒转染NK-92细胞（标记为HBV?NK-92）。与从CHB患者中分离的原代NK细胞相似，HBV?NK-92细胞携带HBVrcDNA和HBVRNA（HBx和HBs/p）。以人慢性髓系白血病细胞K和HepG2肿瘤细胞系作为靶细胞，HBV?NK-92细胞介导的细胞毒作用比HBV?NK-92对照细胞介导的细胞毒作用低10％左右（图5a）。同时，在HBV?NK-92细胞中还观察到CDa以及细胞毒性介质穿孔素和颗粒酶B（GramB）的低表达（图5b）和细胞内IFN-γ的水平降低（图5c）。此外，细胞周期分析表明与对照细胞相比，HBV?NK-92细胞的增殖能力也受到了抑制（图5d），细胞停滞在G0/G1期（图5e）且凋亡率增加（图5f）。以上数据表明，HBV可以直接干扰NK细胞的功能和生存。

图5.HBV成分抑制NK细胞功能和细胞活力。

（a）使用CFSE/7AAD实验评估细胞毒作用。（b）使用流式细胞仪分析HBV?NK-92和HBV?NK-92细胞中脱颗粒分子CDa以及细胞内细胞毒性介质穿孔素和GramB的水平。（c）使用流式细胞仪分析了HBV?NK-92和HBV?NK-92细胞内IFN-γ与TNF-α的水平。（d）使用MTT法分析HBV?NK-92和HBV?NK-92细胞的增殖能力。（e）使用流式细胞仪分析HBV?NK-92和HBV?NK-92细胞的细胞周期。（f）使用PI和APC标记的膜联蛋白V通过流式细胞术分析血清饥饿后HBV?NK-92和HBV?NK-92细胞的凋亡率。Star：血清饥饿，Untr：未处理。

06

HBV抑制NK细胞中RIG-Ⅰ的表达及下游信号通路

有研究表明CHB患者的NK细胞对激活信号的反应性减弱。作者进一步研究了HBV如何影响NK细胞及其信号通路。聚肌胞苷酸（poly(I:C)）可模仿病毒双链RNA，并与IL-2协同作用，诱导NK细胞产生IFN-γ。用poly(I:C)刺激HBV?NK-92和对照HBV?NK-92细胞，与对照细胞相比，HBV?NK-92细胞中CDa、细胞毒性介质穿孔素和GramB以及IFN-γ的表达水平均降低（图6a、b）。

图6.HBV抑制了NK细胞中RIG-Ⅰ的表达及其下游信号通路。

（a）使用流式细胞仪分析了响应于聚肌胞苷酸（poly(I:C)）刺激的HBV?NK-92细胞中CDa、穿孔素和GramB的水平。（b）使用流式细胞仪分析了响应于聚（I：C）刺激HBV?NK-92细胞胞内IFN-γ和TNF-α的水平。（c）HBV?NK-92和对照细胞中的TLR和RIG-ⅠmRNA（左）和蛋白质（右）水平。（d）通过流式细胞术评估HD和CHB患者CD56+CD3-NK细胞中RIG-Ⅰ表达水平。（e）使用pcDNA5-RIG-ⅠCARD质粒转染HBV?NK-92细胞（左），并分析了CDa的表达（右）。（f）响应聚肌胞苷酸（poly(I:C)）刺激，HBV?NK-92细胞中NF-κB（p65）和p38活化的蛋白质印迹分析（左）。对p-NF-κB和p-p38表达光密度的分析，以聚肌胞苷酸（poly(I:C)）刺激15min的NK-92细胞的总蛋白水平进行标准化，对照组未受刺激的HBV?NK-92细胞设置为1（右）。（g）HD和CHB患者的原代CD56+CD3-NK细胞中NF-κB（p65）和p38磷酸化水平。在经CHB患者的外泌体处理后，使用流式细胞仪分析了HD的NK细胞中RIG-Ⅰ的表达（h），NF-κB和p38磷酸化水平（i）。

该研究进而分析了HBV核酸是否会影响NK细胞中包括TLR3、TLR7、TLR9和RIG-Ⅰ在内的与病毒识别相关的模式识别受体（PRR）的表达。如图6c所示，NK-92细胞中PRR的表达水平，尤其是RIG-Ⅰ的水平在转染pLMP-HBV质粒后明显下调。与健康供体的NK细胞相比，CHB患者的原代NK细胞中RIG-Ⅰ的表达水平降低（图6d）。为了进一步确认RIG-Ⅰ是否与HBV感染期间NK细胞的功能异常有关，作者用含有RIG-ⅠCaspase募集结构域的质粒转染HBV?NK-92细胞后发现，NK细胞在HBV感染期间表达减少的CDa因RIG-Ⅰ的过表达而得以部分恢复（图6e）。考虑到NF-κB和MAPK通路与NK细胞活化和细胞因子产生有关，作者在NK-92细胞中监测了与NF-κB和MAPK活化有关的信号分子，HBV?NK-92细胞中的NF-κB和p38MAPK磷酸化水平低于HBV?NK-92细胞（图6f），但未观察到MAPK途径中ERK、c-Jun和JNK磷酸化水平的显著变化（数据未显示）。与此相一致，CHB患者原代NK细胞的NF-κB和p38MAPK磷酸化水平低于健康供体的NK细胞（图6g）。在用HBV+外泌体处理的健康供体的原代NK细胞中也观察到了类似的现象（图6h和i）。以上结果提示，HBV可能以RIG-I依赖的方式直接干扰NK细胞的功能，抑制NF-κB和p38的激活。

讨论

综上所述，该研究结果提示存在外泌体介导的、以受体非依赖性的方式播散HBV的可能性（图7），外泌体可以像游离病毒感染肝细胞一样有效地将HBV传递到未感染的肝细胞中。但从现有的文献报道看，尚无实验数据能够支持这一观点。此外，HBV可以通过外泌体转移到NK细胞中，通过下调RIG-I表达并使NF-κB和p38通路失活，从而诱导NK细胞的功能耐受。这些观察结果表明，外泌体可能是HBV传播的重要调节方式，并可能参与固有免疫逃逸。

文献来源：

YangY,HanQ,HouZ,ZhangC,TianZ,ZhangJ.ExosomesmediatehepatitisBvirus(HBV)transmissionandNK-celldysfunction.CellMolImmunol.;14(5):–.doi:10./cmi..24

文字：彭思雯

排版：李德瑶

校对：高林

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