清华大学医学院丁强课题组报道戊型肝炎病毒

年5月20日，清华大学医学院丁强课题组在国际学术杂志《PLOSPathogens》在线发表题为“IdentificationofFunctionalcis-actingRNAElementsintheHepatitisEVirusGenomeRequiredforViralReplication”的研究论文。该论文首次利用HEV非结构蛋白ORF1反式互补系统，鉴定HEV基因组中参与病毒复制的功能性顺式作用元件，在ORF1和ORF2编码区内发现了两个高度保守的顺式作用RNA元件；并通过RNA免疫沉淀（RIP）技术和RNApulldown技术分析了这些顺式作用元件促进病毒复制的机制，对我们理解病毒的生命周期和开发以RNA导向为基础的HEV治疗方案具有重要意义。

戊型肝炎（HepatitisE）是潜在的对人类健康构成重大威胁的传染病，每年在世界范围内引起约万例感染，并导致约60,人死亡。然而，现在还没有开发出直接针对治疗戊型肝炎的特效药，各项对于戊型肝炎病毒（HEV）生命周期的研究也未取得突破，对HEV复制的更好理解可以促进针对这一关键过程的新药的开发。研究发现，HEV基因组中的RNA元件与HEV的复制蛋白相互作用可以促进病毒复制，表明这些RNA元件可作为病毒复制复合物募集和组装的支架。

HEVORF1反式互补细胞培养系统是一种利用携带HEVORF1基因的慢病毒转导HepG2C3A肝癌细胞，从而研究HEV复制和转录的有效工具。在该系统中，转导的ORF1可以反式发挥功能，提供HEVRNA复制所需的聚合酶活性，为将病毒RNA功能与蛋白质翻译解偶联提供了独特的机会。研究人员通过利用该ORF1反式互补系统对整个HEV基因组进行了系统性筛选，在ORF1和ORF2编码区域中发现了两个功能性顺式作用RNA元件（分别为核苷酸–和–区域），该两个顺式作用元件在其他7个HEV基因型中高度保守，同时作者也发现HEV基因组多个区域删除并不影响病毒基因组复制这表明HEV基因组具有灵活性和耐受性，可用于开发成为转基因载体。

为了进一步验证发现的RNA顺式作用元件的重要性，研究人员在不同毒株的复制子模型和病毒感染的过程中研究了其作用。通过在KernowC1/p6-Gluc（rHEV-Gluc）的ORF1序列的nt-nt区域和在ORF2序列的-nt区域中分别在每3或4个氨基酸引入同义突变，研究者发现与亲本序列相比，在用rHEV-GlucSMs转染的细胞上清液中，Gluc活性显着降低，证明核苷酸G（ORF1）和G(ORF2)特别重要。通过将亲本KernowC1/p6和同义突变基因组的病毒基因组RNA转染到人肝癌细胞系S10-3中，研究者进一步证明了G（ORF1）和G(ORF2)对于产生感染性子代病毒也十分重要。

▲图2.顺式作用RNA元件中的同义突变严重影响HEV的复制

为进一步研究这些顺式作用元件促进病毒复制的机制，研究者通过RNA沉淀（RIP）和RNApulldown技术发现顺式作用元件可以形成特殊的RNA二级结构，和病毒的RNA聚合酶结合复制病毒基因组。研究者发现位于ORF2的顺式作用元件可以跟3‘非翻译区的碱基互补配对形成RNA二级结构。在ORF2的顺式作用元件中引入单碱基突变，这一RNA二级结构被破坏后，病毒的RNA聚合酶不能识别复制自身的基因组。然而，在此突变体基础上，同时在3‘非翻译区引入互补碱基来恢复RNA二级结构后，病毒可以重新识别复制自身的基因组。这一结果解释了戊型肝炎病毒的复制酶如何在宿主浩瀚的RNA海洋里精确地找到自身的基因组，进而进行高效的复制。同时，鉴定出这些重要的顺式作用元件，为将来开发以RNA为基础的治疗方案和用戊型肝炎病毒基因组作为基因递呈载体提供了重要依据。

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