乙肝病毒cccDNA形成机制研究获得突破

前言

乙型肝炎病毒（HBV）感染是引起急性和慢性乙型肝炎、肝硬化及肝细胞癌（HCC）的主要原因。全球约有2.57亿HBsAg阳性的HBV慢性携带者，中国约占其中的30%[1]。感染肝细胞核内的共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV复制的模板，相对稳定，其持续活跃的存在是慢性感染的病毒学基础。临床上多将肝功能恢复正常、HBsAg消失和/或抗HBs阳转、血清HBVDNA低于检测下限称为“功能性治愈（functionalcure）”[2]。此时作为病毒复制模板的cccDNA无论是消失，还是维持在无转录活性的状态，这些患者停药后发生HBVDNA反弹和疾病复发的风险都大为降低。由于现有的抗病毒治疗药物均不能有效地清除所有感染肝细胞核内的cccDNA，如何彻底治愈慢性乙肝（CHB）仍是一个巨大挑战。然而，现有药物特别是核苷（酸）类（NAs）药物治疗下患者的HBsAg血清学阴转的发生率很低，每年仅为约0.5%~1%[3]，以至于大多数患者都需要终身用药[4]。由此可知，如何有效的靶向清除cccDNA，是达到有效临床治愈慢性乙肝的关键所在。

既往研究中，人们曾错误地认为cccDNA的半衰期长达14年之久，然而近年来更多的证据表明，绝大部分活跃转录的cccDNA半衰期多在40~50天左右。我们知道，cccDNA的来源有二，其一是新感染病毒核衣壳内的病毒基因组rcDNA(开链环状的不完全双链DNA)；其二是通过cccDNA的内补充机制，即已存在于细胞核内的cccDNA的前基因组RNA（pgRNA），于胞质核衣壳内在病毒P蛋白的逆转录酶和DNA聚合酶的作用下从头新合成的rcDNA[5]。活动性慢性乙型肝炎患者中，由于cccDNA在感染肝细胞的增殖过程中会被稀释、丢失，加之新生肝细胞对再感染的抵抗[6]，内补充机制对维持cccDNA的稳定和患者的持续感染至关重要。目前，我们尚缺乏直接作用于cccDNA的技术手段与药物，如此一来，阻断cccDNA的内补充，将是治愈乙肝有潜力的治疗策略。而在分子水平认识rcDNA在细胞核内向cccDNA的转换过程，研发相应的靶向药物，将是实现该策略的关键所在。

HBV感染过程中，进入细胞核内的开链不完全双链DNA转换为共价闭合环状的cccDNA所需要的步骤：①首先要去掉完整负链DNA5’端与之共价结合的P蛋白和曾作为正链DNA合成引物的正链5’端的pgRNA残留片段，形成各自的两个游离末端；②rcDNA的不完整正链需要被补齐；③正负链在聚合酶的作用下补全补齐缺口，各自形成cccDNA（如下图所示）。

图1.HBVrcDNA转换为cccDNA的关键步骤。（图片来自参考文献7，有修改）

近年来，学者们一直在努力寻找参与上述过程的关键细胞功能蛋白，且取得了一些进展。但由于缺乏有效的研究体系，该困局的全貌一直未能解开。3月9日发表在NatureMicrobiology的一项研究首次揭示了这一过程[9]，在该研究中，作者首先合成出了病毒的负链和正链DNA序列，通过高温变性后退火形成双链DNA，并分别在正负链的5’端连接上一个DNA襟翼和RNA-DNA寡核苷酸序列，来模拟去除蛋白后的dp-rcDNA（typeAdp-rcDNA）(原文Fig.1a–c);为了更好地模仿图1中的另外两种可能的转换中间体形式，作者以负链不带有5’端侧翼序列的正负合成单链直接退火来模拟typeBdp-rcDNA，以负链带有生物素标记襟翼的退火双链来模拟typeCdp-rcDNA（该文中简称RrcDNA），详见图1b。为了更好地模拟自然状态下的rcDNA，作者进而又在生物素标记的负链5’端连接上抗生物素蛋白NeutrAvidin，形成NeutrAvidin–RrcDNA（NA–RrcDNA）（图1d底部）。并通过凝胶电泳验证了NA–RrcDNA与病毒颗粒来源的rcDNA有着相同的迁移特征。进而将这些结构转染进HepG2，除了NA–RrcDNA因转染效率太低未能成功外，其他组均在培养上清中检测到了反映cccDNA存在和活跃转录的病毒学标志物HBeAg。

考虑到酵母细胞有着与哺乳动物细胞一样的DNA修复机制，接下来作者首先验证了dp-rcDNA是否能在酵母细胞来源的DNA修复系统作用下转换为cccDNA，以寻找这一转换过程中至关重要的蛋白分子。考虑到这些DNA修复相关的分子并不仅限于细胞核内，作者分别将来自酵母细胞胞核和胞质的提取物开展体外研究。结果发现，两者均能够将RrcDNA转换为cccDNA（原图Fig.2a）。为完善证据，除了对新形成的cccDNA的测序验证外，作者还用三种不同的方法验证了实验产生的RcccDNA的cccDNA特性。

Fig.2

PCNA,RFC