乙型肝炎病毒Precore和Core蛋白

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摘要

此文利用HBc/HBeAg转基因（transgenic，Tg）小鼠与表达HBc/HBeAg特异性T细胞受体（TCR）的Tg小鼠杂交，模拟慢性HBV感染时的HBc/HBeAg暴露，探究HBVPrecore和Core蛋白诱导T细胞免疫耐受的机制。研究发现了HBe/HBcAg特异性T细胞耐受的三种表型：（1）由克隆清除介导的T细胞耐受；（2）T细胞克隆忽视；（3）依赖于耐受原结构、位置和浓度的非清除性克隆失能，其中分泌型的HBeAg明显比细胞内HBcAg更有效地诱导T细胞耐受。

表1.分别表达不同水平HBeAg或HBcAg的转基因小鼠信息。表2.表达HBc/HBeAg高、中、低亲和性TCR的转基因小鼠信息。TCR×Ag-Tg小鼠：表达HBc/HBeAg高、中、低亲和性TCR的转基因小鼠与表达高（hi）、中（EntireHBV）、低（lo）水平HBc/HBeAg抗原的转基因小鼠杂交。

01HBc/HBeAg特异性T细胞耐受的不同表型

通过测定培养上清IL-2、IFN-γ水平和细胞增殖能力，检测HBc/HBeAg体外诱导TCR×Ag-Tg小鼠脾脏T细胞耐受的能力。结果显示，8/12-2-Tg小鼠的T细胞在相对低浓度HBc/HBeAg的处理下被有效激活。与8/12-2-Tg小鼠相比，7/16-5-Tg小鼠T细胞需要更高剂量的抗原刺激才能产生IL-2，且水平较低。这证明8/12-2-Tg小鼠的T细胞比7/16-5-Tg小鼠T细胞对HBc/HBeAg的亲和力更高（图1A第1行）。11/4-12-Tg小鼠T细胞更倾向于识别HBeAg而非HBcAg，11/4-12×HBc(lo/hi)-Tg及11/4-12×HBe(lo/hi)-Tg小鼠T细胞均产生了与11/4-12-Tg小鼠T细胞相同水平的IL-2（图1A第3列）。

与8/12-2-Tg小鼠相比，8/12-2×HBe(lo)-Tg小鼠的T细胞经HBc/HBeAg刺激后产生IL-2的水平显著降低。而8/12-2×HBe(hi)-Tg小鼠的T细胞在HBc/HBeAg处理后则完全不产生IL-2。8/12-2×HBV-Tg小鼠体内T细胞也无IL-2的产生。这些结果提示，血清HBeAg在体内HBV复制模型中具有引起HBeAg及其它病毒蛋白耐受的潜力（图1A第1列）。

7/16-5×HBe(lo)-Tg小鼠T细胞与7/16-5-Tg小鼠T细胞产生IL-2水平相当，体内低浓度HBeAg和HBcAg并没有引起7/16-5T细胞耐受。而体内HBeAg浓度较高的7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠与7/16-5-Tg小鼠相比，T细胞产生的IL-2明显减少。7/16-5×HBc(hi)-Tg小鼠T细胞的耐受不明显，小鼠在4~6周龄时发生自发的抗HBc血清学转换，且持续为抗HBc抗体阳性（图1B）。而7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠在体内不能自发产生抗HBe抗体。体外HBcAg处理后7/16-5×HBc/HBe-Tg小鼠的T细胞均产生抗HBcIgM抗体，而只有7/16-5×HBc(hi)-Tg小鼠产生抗HBcIgG抗体（图1C）。上述结果表明，7/16-5×HBc/HBe-Tg小鼠体内7/16-5TgT细胞的耐受诱导是非克隆清除性的，也是HBeAg浓度依赖性的。7/16-5×HBe-Tg小鼠诱导耐受，7/16-5×HBc-Tg小鼠不诱导耐受。

图1.HBc/HBeAg特异性T细胞耐受的不同表型。A.用不同浓度的HBcAg（HBc）/HBeAg（HBe）处理小鼠脾细胞，通过检测IL-2的产生来测定TCR-Tg及TCR×HBc/HBe-Tg小鼠中HBc/HBeAg特异性T细胞的活化（+/+，野生型；ND，未检测到）。B.7/16-5×HBc(hi)-Tg小鼠自发抗HBc血清学转换。C.7/16-5-Tg、7/16-5×HBe(hi)、7/16-5×HBc(hi)-Tg小鼠体外不同浓度HBc/HBeAgs处理后培养上清抗HBcIgM、IgG抗体产生情况。

02双转基因小鼠耐受机制探究

1.8/12-2×HBe双转基因小鼠8/12-2-Tg小鼠T细胞对低浓度HBeAg诱导的耐受非常敏感，这一事实预示T细胞克隆清除可能是耐受的机制。然而，因为8/12-2-Tg小鼠T细胞配对的Vα链只能来源于内源基因，HBeAg特异T细胞的含量很低，所以无法通过流式细胞仪（FACS）验证是否的确为T细胞克隆清除。已知T细胞表面死亡受体FAS（TNFreceptorsuperfamilymember6）的激活可诱导T细胞凋亡诱发免疫耐受。HBc/HBeAgp~多肽序列是8/12-2-Tg小鼠及野生型B10.S小鼠T细胞的识别位点，通过比较p~多肽在HBe(lo)-Tg小鼠与FAS缺失（lpr/lpr）HBe(lo)-Tg小鼠（HBe(lo)/lpr）诱导的抗HBe抗体生成，发现较低血清HBeAg浓度足以诱导FAS介导的周围细胞凋亡。HBe(lo)-Tg小鼠对HBeAg具有高度的耐受性，注射p~后，只产生瞬时、低水平的、且主要为IgG2b亚型的抗HBeIgG抗体（图2）。HBe(lo)/lprTg小鼠产生了更多的抗HBe抗体，且IgG亚型分布更广，表明FAS介导的外周细胞凋亡可能有助于维持T细胞对HBeAg的耐受性。在高亲和度T细胞中，克隆清除和FAS诱导的凋亡机制都在HBeAg特异性耐受中发挥作用。图2.比较HBe(lo)与HBe(lo)/lpr-Tg小鼠抗HBe抗体的产生情况。小鼠注射HBc/HBeAg特异T细胞多肽p~，测定血清抗HBeIgG抗体。2.11/4-12×HBc/HBe双转基因小鼠以往研究报道，11/4-12×HBc/HBeAg(lo)-Tg小鼠的胸腺或脾脏中T细胞没有克隆清除。该研究对11/4-12×HBc/HBe(hi)-Tg小鼠的FACS分析也发现，小鼠胸腺或脾脏无T细胞克隆清除发生。11/4-12-Tg小鼠T细胞并没有因为双Tg小鼠中HBc/HBeAg的高表达而改变IL-2的产生。可见低亲和度11/4-12-Tg小鼠T细胞不被高水平的HBc/HBeAgs诱导耐受，也不被激活，提示在体内T细胞与这些病毒抗原共存是由于克隆忽视。3.7/16-5×HBc/HBe双转基因小鼠FACS结果提示7/16-5×HBc(lo/hi)-Tg和7/16-5×HBe(lo/hi)-Tg小鼠胸腺或脾脏无T细胞克隆清除。在体外，7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠T细胞HBeAg特异IL-2和IFN-γ水平低于7/16-5-Tg和7/16-5×HBc(hi)-Tg小鼠（图3A）。7/16-5-Tg和7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠T细胞用胞内荧光染料CFSE及抗TCRVβ11抗体标记，加入p~多肽培养，通过FACS检测Vβ11+T细胞，比较7/16-5-Tg小鼠和7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠T细胞的体外增殖能力。结果提示来自7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠的T细胞具有增殖能力，但是相较7/16-5-Tg小鼠来源的T细胞，其增殖相对缓慢。7天后7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠与7/16-5-Tg小鼠相比，有更多的T细胞终止分裂。同样，来自7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠T细胞分裂总数也少于7/16-5-Tg小鼠T细胞（图3B）。因此，7/16-5-TgT细胞在血清高HBeAg水平的情况下呈现失能状态。T细胞失能分为克隆性失能和适应性耐受两大类，因为7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠IFN-γ和IL-2产生受到抑制，不被外源性IL-2逆转且失能状态需要抗原维持，作者对此更倾向于认为是适应性耐受。图3.7/16-5×HBc/HBe-Tg小鼠耐受机制。A.7/16-5-Tg和7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠脾T细胞经HBc/HBeAg特异T细胞多肽p~处理后IL-2和IFN-γ水平检测。B.7/16-5-Tg和7/16-5×HBe(hi)-Tg小鼠T细胞增殖能力比较。脾细胞用胞内染料CFSE标记，加入p~培养后收获细胞，标记抗-TCRVβ11抗体。细胞分裂由Vβ11+T细胞CFSE染料的稀释来测量。曲线上方的数字代表进行细胞分裂的Vβ11+T细胞的比例。

03HBeAg特异性T细胞对HBV感染的影响

1.分泌的HBeAg是多克隆T细胞的耐受原采用HBcAg免疫野生型B10.S和HBe(hi)-Tg小鼠，验证HBeAg的耐受是否会影响HBcAg的免疫应答。与B10.S鼠相比，HBcAg免疫HBe(hi)-Tg小鼠后抗HBcIgG抗体减少（图4A），IFN-γ产生也减少（图4B）。这说明B10.S小鼠多克隆HBc/HBeAg特异T细胞与8/12-2-Tg谱系相似，HBeAg诱导的耐受影响HBcAg的特异性免疫应答。HBe(hi)-Tg小鼠在体内不会自发产生抗-HBe，而HBc(hi)-Tg小鼠可自发血清转化为抗-HBc，提示HBcAg在该多克隆T细胞模型中引起耐受的潜能较低，与在TCR×HBc-Tg小鼠中结果相似。2.围产期暴露于HBeAg易引起免疫耐受为确认出生后早期暴露于HBeAg是否也能引起免疫耐受，使用HBe(hi)-Tg小鼠进行研究，该小鼠出生时血清HBeAg阴性，出生后第7天可检测到HBeAg，并在4周时达到稳定水平。3~4周龄野生B10.S小鼠和HBe(hi)-Tg鼠用HBeAg免疫后，测定IL-2水平（图4C）。结果显示，虽然HBe(hi)-Tg小鼠出生时HBeAg阴性，但在3~4周龄接种HBeAg后，抗原特异性T细胞的IL-2的产生仍然具有耐受性。因此出生后暴露于HBeAg可诱导T细胞耐受。这表明HBeAg引起的T细胞耐受不仅可以在子宫内获得，也可在分娩后发生。图4.A.B10.S野生型（B10.S/+）和HBe(hi)-Tg小鼠用HBcAg免疫，检测血清抗HBcIgG。B.图A来源的脾细胞经不同浓度HBcAg处理后，检测培养上清IFN-γ水平。C.3~4周龄B10.S/+和HBe(hi)-Tg鼠HBeAg免疫后收集脾脏细胞，以不同浓度的HBc/HBeAg特异T细胞多肽p~处理细胞，检测细胞上清IL-2水平。3.HBeAg的免疫调节作用7/16-5×HBc(lo)-Tg和7/16-5×HBe(lo)-Tg小鼠对HBc/HBeAg无耐受性，在这些小鼠体内，T细胞与低水平的特异性抗原共存，提供了一个中等亲和力的T细胞模型，可以验证注射TCR特异性多肽p~是否可以激活这些静止T细胞。p~多肽可激活7/16-5×HBc(lo)-Tg小鼠的T细胞，引起较低程度的偶发性慢性肝损伤，对7/16-5-Tg和HBc(lo)-Tg小鼠没有明显的肝损伤。在7/16-5×HBe(lo)-Tg小鼠中注射p~多肽可导致抗-HBe发生血清学转换，但无或仅有有限的肝损伤（图5A）。值得注意的是，p~多肽在7/16-5×HBe(lo)-Tg小鼠中诱导产生的抗HBe抗体是短暂的，而p~多肽在7/16-5×HBc(lo)-Tg小鼠中诱导产生的抗-HBc抗体是持续存在的（图5B），提示HBeAg具有免疫调节功能。7/16-5×HBc(lo)×HBe(lo)-Tg小鼠注射p~，产生了抗-HBe抗体，但未产生抗-HBc抗体（图5B），这表明，血清中HBeAg的存在可以下调HBcAg的抗体生成。注射p~的7/16-5×HBc(lo)-Tg小鼠ALT升高频率较高，而7/16-5×HBe(lo)-Tg和7/16-5×HBc(lo)×HBe(lo)-Tg小鼠的肝脏损伤较弱；提示血清中HBeAg的存在抑制了p~诱导的肝损伤。这些数据表明，HBeAg可能在自然HBV感染中发挥免疫调节作用，分泌HBeAg可下调HBcAg的免疫应答。图5.HBeAg的免疫调节作用。A.7/16-5×HBc(lo)-Tg小鼠注射p~后检测血清ALT水平。B.7/16-5TCR特异多肽p~诱导7/16-5×HBc/HBe-Tg小鼠、7/16-5×HBc×HBe-Tg小鼠血清学转换。

4.HBeAg和HBcAgT细胞免疫耐受的差异

7/16-5×HBc(hi)-Tg小鼠在4~6周龄时自发发生血清学转换为抗HBc阳性，而HBcAg表达水平较低的7/16-5×HBc(lo)-Tg小鼠则没有。因此，低水平的HBcAg似乎限制了免疫原性，而高水平的HBcAg是免疫原性的。相比之下，7/16-5×HBe(lo/hi)-Tg小鼠均不会自发产生抗HBe抗体。通过注射7/16-5TCR特异性肽p~，观察其诱导7/16-5×HBc/HBe-Tg小鼠产生抗HBc/HBe抗体的能力。结果显示7/16-5×HBc/(lo/hi)-Tg小鼠均可产生抗HBc抗体，且高HBcAg表达与高抗体滴度相关。相反，只有低表达的HBeAg可以诱导产生抗HBe抗体。将7/16-5-Tg小鼠脾脏细胞过继转移到HBcAg-Tg小鼠，HBc(hi)-Tg小鼠产生高效的抗-HBc抗体，HBc(lo)-Tg小鼠产生低水平的抗-HBc抗体。相比之下，将相同数量的7/16-5-Tg脾细胞过继转移到HBe(hi)-Tg小鼠没有抗HBe抗体产生，而转移到HBe(lo)-Tg小鼠只有极低水平的抗HBe抗体产生。这表明，血清HBeAg发挥耐受原作用不需要在出生时存在，甚至不需要在围产期存在。在HBe-Tg小鼠中，成熟7/16-5-TgT细胞相对较短时间暴露于HBeAg即足以引起T细胞耐受，减少抗HBe抗体的产生。体内HBcAg浓度与免疫原性呈正相关，而HBeAg浓度与免疫原性呈负相关。HBeAg和HBcAg之间这种明显的耐受性差异可能是由于单体HBeAg被分泌，而HBcAg位于细胞内。

总结

HBeAg特异性T细胞耐受主要通过三种表型：（1）由克隆清除介导的T细胞耐受；（2）T细胞克隆忽视；（3）依赖于耐受原结构、位置和浓度的非清除性克隆失能。高亲和力的HBeAg特异性T细胞可能被克隆清除，并且在慢性感染形成后不能参与抗病毒清除机制。而中或低亲和力HBeAg特异性T细胞则没有被克隆清除，有可能逆转耐受或再次被激活。据此作者认为，慢性HBV感染的免疫治疗方式应以激活相对较低亲和力HBeAg特异性T细胞为目标。此外，作者从7/16-5-Tg小鼠T细胞的研究结果推论，维持HBeAg特异性T细胞耐受性需要相对高浓度的HBeAg，而打破这种耐受或许并不需要完全消除HBeAg。

文献来源：

ChenM,S?llbergM,HughesJ,etal.ImmunetolerancesplitbetweenhepatitisBvirusprecoreandcoreproteins.JVirol.;79(5):–.doi:10./JVI.79.5.-.

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