乙型肝炎病毒S基因整合对抗病毒治疗后乙型

摘要

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是我国乃至亚洲大部分地区肝脏炎症、肝硬化和肝细胞癌（HCC）发生的主要原因。既往研究表明，抗病毒治疗可以有效延缓慢性乙型肝炎（CHB）疾病进展、降低肝硬化和HCC的发生率。与干扰素治疗相比，口服核苷（酸）类似物（NAs）具有更强的抑制病毒复制的作用。近年来，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）作为共价闭合环状DNA（cccDNA）的转录表达产物，已成为监测抗病毒疗效的重要血清标志物。各大指南均将血清HBsAg清除作为功能性治愈和判断停药的重要指标。

然而，江建宁教授团队在其一项长达14年的随访研究中发现，接受抗病毒治疗患者的血清HBsAg的10年累计清除率仅为14%。其另一项停药队列研究表明，约20%的CHB患者在停药后3~9年血清HBVDNA水平持续阴性（低于检测下限），但仍有高水平的HBsAg。作者还发现，部分慢性HBV感染者在其HBVDNA自然清除（低于检测下限）3~10年后，其HBsAg仍呈阳性甚至处于较高水平。显然，如果上述患者继续按照指南的推荐意见服用NAs，可能会导致过度治疗。研究证实，乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性的CHB患者血清HBsAg水平与HBVcccDNA无明显相关性，这种不相关的可能原因，除了来源于cccDNA外，HBsAg也可来源于HBV整合的S基因。为厘清长期抗病毒治疗患者HBsAg持续阳性的原因，在此文中江教授团队探索了整合到宿主基因组中的HBVS基因对持续抗病毒治疗下CHB患者血清HBsAg水平产生的影响。

01患者临床特征

这项回顾性队列研究共招募了年9月~年6月期间就诊于广西医院感染科的例住院CHB患者。本研究仅对服药依从性和随访情况良好的患者进行分析。纳入标准为：血清HBsAg阳性至少6个月；患者先行肝脏组织学检查，并在肝活检后2周内开始接受NAs治疗，6个月内实现病毒学完全应答，并至少维持4年。排除标准包括：合并感染丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒；患有急性肝炎、肝硬化、肝细胞癌；有干扰素治疗或免疫抑制治疗史；随访期间出现NAs耐药。最终70例符合本研究要求。其中，在基线肝活检标本中，11例（15.7%）发现HBVS基因整合。经过4年的NAs抗病毒治疗后，所有患者血清HBsAg均未转阴，但值得注意的是，未整合组中两例患者血清HBsAg水平已经接近转阴。

02NAs抗病毒治疗下HBsAg水平变化的影响因素

根据抗病毒治疗后2~4年HBsAg下降幅度将患者分为两组：HBsAg降幅≤2log10IU/mL为A组，降幅2log10IU/mL为B组。为探讨影响HBsAg水平的因素，分别对患者性别、年龄、乙型肝炎家族史、基线HBVDNA载量、基线谷丙转氨酶（ALT）水平、基线HBsAg水平、HBeAg状态、HBV基因型、治疗药物和HBVS基因整合等10个可能影响患者血清HBsAg水平的因素进行Logistic回归分析。结果如表1所示，HBVS基因整合是影响两组患者HBsAg下降幅度的主要因素，且两组数据差异具有显著性（P0.05），其他因素影响不明显（P0.05）。

根据肝组织活检S基因整合分析结果，将患者分为整合组和非整合组。比较两组患者的性别、平均年龄、平均治疗时间、HBeAg状况、家族史、HBVDNA、HBsAg和ALT基线水平、HBV基因型等因素，两组间差异无显著性（P0.05）。

表1：NAs治疗下HBsAg水平影响因素的Logistic回归分析

回归方程:logit（P）=0.56+2.X，OR，优势比。LAM，拉米夫定；ADV，阿德福韦酯；LdT，替比夫定；ETV，恩替卡韦。

03乙型肝炎表面抗原水平的动态变化

观察整合组和非整合组HBsAg水平的动态变化，两组基线HBsAg水平差异无显著性（P0.05），在接受有效NAs抗病毒治疗后的前2年，两组血清HBsAg水平均较基线迅速下降，下降幅度无统计学差异（2.63logIU/mLvs.2.65logIU/mL，P=0.）（图1）。推测该阶段HBsAg的迅速下降可能是由于NAs治疗下cccDNA池补充不足所致。但在接受NAs治疗后的2~4年，非整合组血清HBsAg水平持续下降，而整合组HBsAg水平基本保持不变，非整合组HBsAg水平下降幅度明显大于整合组（2.53logIU/mLvs.0.1logIU/mL,P=0.）。根据这些观察结果，有理由推测非整合组的cccDNA数量及转录活性由于持续2年的NAs治疗而减弱甚至消失，从而导致cccDNA来源的HBsAg逐渐低表达或表达沉默，使血清HBsAg持续下降直至检测不到。而在整合组，由于整合的S基因仍能表达HBsAg，使血清HBsAg维持在一定水平。

图1：整合组和非整合组HBsAg水平下降幅度的比较。

04HBVS基因整合位点

在本研究中，肝活检标本中确定的HBVS基因序列和宿主基因组连接片段分别定位于人染色体3q26、10q23、10q22、15p11.1、3p13和12q13位点。相应位点周围的人类基因分别为RP13-、RP11-O3、CDH23、RP11-A17、RP11-E6和RP11-A11。对人类基因序列进行精细定位发现，4个整合位点同时含有人类基因的启动子序列和启动子调控序列，另外2个整合位点仅存在启动子调控序列（图2、3）。正是由于这些整合位点位于人类基因启动子区和启动子侧翼调控区域内，整合的HBVS基因可能通过宿主启动子调控而转录产生HBsAg。此外，由于整合HBV片段中S基因区相对完整，病毒来源的SP1和SP2启动子活性同样有能力驱动preS1、preS2和SmRNA的转录。

图2：受试者染色体上有6个整合位点。图中的红色箭头表示位点的位置。

图3：以整合位点3q26为例。该整合位点对应的人类基因为人类基因RP13-，全长.19kb。

Enhancer，增强子；PromoterFlank，启动子侧翼区；Promoter，启动子。

总结

综上研究结果提示，血清HBsAg除了来源于感染肝细胞核内存在的cccDNA转录表达外，还来源于整合的HBVS基因的表达，这表明仅用血清HBsAg作为cccDNA活性的标志物存在一定的假阳性率，且将HBsAg的完全清除作为CHB患者临床治疗的唯一终点具有一定的局限性。今后的研究重点应放在建立能够区分不同来源的HBsAg的方法，以及寻找能够可靠地反映cccDNA转录活性的血清标志物以指导临床实践。

越来越多的研究显示，在包括血清前基因组RNA（pgRNA）、HBcrAg等新老HBV病毒学指标中，血清pgRNA可能比血清HBsAg水平更能可靠地反映cccDNA的转录活性。如果未来将血清HBsAg水平和pgRNA水平联合作为慢性乙型肝炎患者接受NAs治疗的安全停药标准，是否更合理、更科学？相信这将是一个值得探讨的临床问题。

该论文于年1月23日得到“世界卫生组织病毒性肝炎和全球艾滋病项目”顾问、美国肝病学会《慢性乙型病毒性肝炎防治指南》的共同作者BrianJMcMahon教授的强力推荐，被列入世界学术组织“FPrime”推荐并为美国FDA乙肝新药开发指南所收录的“有趣的假设和新发现”论文。广西医科大学第一临床医学院江建宁教授为第一通讯作者，北京大学基础医学院鲁凤民教授为共同通讯作者。

广西医科大学第一临床医学院江建宁教授（左三）和她的团队，图中右二为该文第一作者胡伯斌。

文献来源：

HuB,WangR,FuJ,etal.IntegrationofhepatitisBvirusSgeneimpactsonhepatitisBsurfaceantigenlevelsinpatientswithantiviraltherapy[J].JournalofGastroenterologyandHepatology,.

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