乙型肝炎病毒HBV病毒转基因动物模型

　　1.HBV转基因模型制作方法一(1)复制方法主要利用各种转基因技术，制作HBV病毒转基因小鼠模型。转基因小鼠模型可分为HBV部分片段及HBV全长或超长序列几种模型。(2)模型特点HBV转基因小鼠对HBV免疫耐受，不引发免疫清除，此模型可用以观察HBV对肝细胞的直接损害作用。含外源启动子的HBsAg转基因小鼠(50-4)产生大量HBsAg的大包膜蛋白，使极长的偶有分枝的杆状HBsAg累积于肝细胞内质网内而不能有效地分泌，肝细胞呈现毛玻璃样改变，从而损伤肝细胞。转基因小鼠HBV标志物主要在肝脏，也可在肾、胰等脏器及外周血中表达，尤其是全长bp1.3拷贝HBV转基因小鼠，血清水平HBVDNA可达3×～9×基因组当量/ml，相当于人慢性HBV感染者中的水平，血中可测到HBsAg，前S1及HBeAg，是药物筛选的一个较好模型。(3)比较医学HBV转基因小鼠模型的建立对于加强HBV分子生物学、免疫学研究，尤其是加强HBV感染肝细胞的分子机制研究，有着重大意义。2.HBV转基因模型制作方法二(1)复制方法选取6～8周龄BALB/cJ小鼠，采用高压水注射方法，通过尾静脉将具有复制能力的HBV质粒导入小鼠体内，每只动物给予15μgHBV质粒，加入总体积为0.1ml/g体重的复方氯化钠溶液，5～7s内尾静脉注射进入小鼠体内。再应用real-timePCR,ELISA,SouthernBlot,NorthernBlot以及免疫组化等方法，检测小鼠病毒血症、血清和肝组织中HBV抗原表达动态变化，肝组织中HBV转录和复制情况，以及免疫应答状况。(2)模型特点该模型在注射后24h内，质粒到达肝细胞，并在这些细胞内大量转录，病毒RNA很快翻译成蛋白质，产生高水平的HBsAg血症及HBeAg血症，同时出现病毒血症。注射后24h，肝细胞内HBcAg表达阳性细胞达到5％。在第2～4日，循环HBsAg及HBeAg水平下降；注射后第7日循环HBsAg及HBeAg水平急剧下降，恰在此时血清中出现相应的抗体。注射后第4日小鼠脾脏开始增大，第7～10日最明显，然后开始回缩，至注射后第20日恢复到原始大小。在抗体出现的同时，肝细胞出现淋巴细胞浸润。CD3/CD8阳性细胞数量于注射后第4日即开始增加，而HBcAg阳性肝细胞数量在注射后第7～10日急剧减少，并且与肝内炎症细胞浸润、病毒RNA和复制中间体的减少相关，同时伴随轻微的血清ALT水平升高。到注射后第20日，肝脏的病毒标志全部消失。(3)比较医学HBV感染后宿主和病毒相互作用的各个方面都可以在这种免疫背景清楚的纯系小动物中复制出来。本方法建立的模型为HBV的研究提供了一种新的途径，特别是HBV病毒学和免疫学的详细研究，只要构建各种已知的HBV变异基因组，就可以在免疫幼稚或正常小鼠体内，也可以在现有的各种转基因小鼠体内研究其生物学特性。同时，本该模型不仅适用于HBV研究，也适用于研究其他肝脏特异性病原，这对具有肝内复制潜能的新现病毒的研究也特别有益。医院（北京）有限公司比较医学中心（以下简称“诺恩诺德比较医学中心”），是我院非常重要的一个临床前研究机构与实验中心。它为公司CRO业务的承接、为公司肿瘤技术与产品的开发、为PDX的的临床的应用与研究提供了保障和基础。诺恩诺德比较医学中心负责人黎立博士，原为医院第八医学中心比较医学中心（实验动物中心）负责人，曾参与国家“十二五”、“十三五”专项课题10余项，曾参与国家自然科学基金项目20余项，曾参与完成国家自然科学基金课题10余项，参与完成军队科研课题20余项；获得国家发明专利8项，发表学术论文30余篇。黎立博士师从郑兆荣教授，郑兆荣教授为吉林大学（中国人民解放军农牧大学）教授、病理解剖学教研室主任、第六届全国政协常委，长期从事病理形态学的研究。同时，黎立博士也与临床医学相关院士保持着良好的合作关系。未来，诺恩诺德比较医学中心将在CRO服务、PDX的临床应用与研究、肿瘤技术与产品的开发、药品、特医食品、医疗器械的研发中，获得更大的成绩，并将为公司在发明专利、课题申报方面做出贡献。

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