新生儿高胆红素血症对血清乙肝病毒表面抗原

作者：史晓敏任娜孙悦侯艳峰李智慧

刘平常乐闫存玲李志艳宋文琪

新生儿高胆红素血症（neonatalhyperbilirubinemia，NHB）为新生儿期常见的表现之一。其病因复杂多样，包括早产、溶血、缺乏母乳、感染、胎龄等。既有生理性的，也有病理性的。与此同时，住院患儿因重度黄疸需要换血治疗或因弥散性血管内凝血（disseminatedintravascularcoagulation，DIC）、贫血、血小板低而需要输入血制品治疗的前后，都需要检测血清感染性指标（包括乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等）。我们在工作中发现，新生儿高胆红素血症标本检测乙肝病毒表面抗原往往会出现弱阳性结果，这部分比例在新生儿住院患者中达到2%~3%，给临床医生对于检测结果的解读带来一定干扰。乙肝病毒表面抗原阳性是因为患儿母亲胎盘传播还是患儿接种乙肝疫苗引起[1]？是患儿血清中的高浓度胆红素还是溶血干扰了实验？如何消除这种影响？成人高胆红素血症是否会表现为同样的乙肝病毒表面抗原弱阳性？为了解答这一系列问题，我们开展了研究工作。

一、对象

选取年7月至年5月在首都医科医院住院，并且血清总胆红素水平超过μmol/L的高胆红素血症[2]新生儿患者血清例，男例，女82例，中位年龄6（4，10）d。同期医院门诊患者检测血清总胆红素水平超过μmol/L的成人血清标本例作为对照组，男例，女20例，中位年龄69（61，74）岁。

本研医院临床研究伦理委员会批准[]，项目名称为：在慢性乙型肝炎感染患者样本中对罗氏、雅培及索林乙肝表面抗原定性检测试剂的性能评估研究。受试者及其家属均签署了知情同意书。

二、方法

1．检测流程：

采集受试者肘静脉血于静脉真空采血管中，2h内行×g、r/min、10min离心，上机检测总胆红素和直接胆红素。采集当天分离血清μl/支于冻存管中保存在-20℃。1个月之内对所有留存血清复温至室温，上机检测乙肝病毒表面抗原。将结果为阳性血清标本进一步经16×g高速离心10min后复测乙肝病毒表面抗原。结果仍为阳性者再经蓝光照射8h后复测乙肝病毒表面抗原。

于采血当天对乙肝病毒表面抗原检测结果为阴性的新生儿标本，用吸管反复吹打血细胞，人为制造溶血状态，经×g、r/min、10min离心后用上清检测血红蛋白浓度，同时上机复测乙肝病毒表面抗原，共计30例。

记录所有受试者的临床诊断，新生儿组同时记录乙肝疫苗接种史、其母亲既往身体情况、乙肝病毒感染情况。

2．检测方法及试剂：

（1）乙肝病毒表面抗原检测：乙肝病毒表面抗原检测采用微粒子化学发光免疫检测法（chemiluminescentmicroparticleimmunoassay，CMIA），在雅培ARCHITECTi0操作系统上进行检测。具体为双抗体夹心两步法检测。第一步，将血清样本和包被有鼠抗人HBsIgM、IgG抗体的顺磁微粒混合。样本中的HBs抗原与微粒结合。冲洗后进行第二步，加入吖啶酯标记的包被有羊抗人HBsIgG的结合物。再次冲洗，将激发液和预激发液加入反应混合物中，测定化学发光反应中的光信号值，以相对光信号单位（relativelightunit，RLU）表示。仪器通过预设的HBs抗原定标曲线，自动计算得出HBs抗原浓度，0.05IU/ml为阳性。（2）总胆红素和直接胆红素检测：总胆红素和直接胆红素检测采用钒酸氧化法，在日立全自动生化分析仪HITACHI上进行。间接胆红素浓度通过测定总胆红素和直接胆红素经相减计算得出。成人总胆红素参考区间为1.7~20.0μmol/L，直接胆红素参考区间为0~6.0μmol/L，间接胆红素参考区间为1.7~22.0μmol/L。儿童尚无中国人群的总胆红素及直接胆红素、间接胆红素参考区间。（3）血红蛋白浓度检测：人为制造溶血标本测定血清血红蛋白浓度采用比色法，在贝克曼DxH上测定。（4）蓝光照射：乙肝病毒表面抗原初次检测结果为阳性的新生儿血清裝于透明塑料Eppendorf管中，暴露在婴儿光疗箱中接受蓝光（nm）照射8h。乙肝病毒DNA检测：乙肝病毒DNA检测采用中山大学达安基因公司乙肝病毒（HBV）核酸扩增荧光检测试剂盒，操作严格按照说明书进行。乙肝病毒DNAIU/ml判定为阴性。

3．统计学方法：

采用SPSS19.0软件进行统计学分析。经Q-Q图正态性检验，新生儿组与成人组年龄、总胆红素和间接胆红素数值均为偏态分布，以中位数（四分位数）表示。

一、新生儿组与成人组基本资料

入选新生儿组与成人对照组基本资料见表1。

表1新生儿组与成人组的基本资料

例新生儿样本中年龄、总胆红素和间接胆红素均为偏态分布，总胆红素中位水平为.0（.5，.5）μmol/L，间接胆红素中位水平为.1（.5，.8）μmol/L。例成人总胆红素及间接胆红素也为偏态分布，总胆红素中位水平为.4（.9，.1）μmol/L，间接胆红素中位水平为.1（.8，.7）μmol/L。新生儿组中例在出生后接受了乙肝疫苗接种，14例未接受乙肝疫苗接种，15例乙肝疫苗接种情况不详。新生儿组患儿母亲有名既往体健，21例患有乙型肝炎、妊娠糖尿病、妊娠高血压、甲状腺功能减低、慢性肾病等疾病，其中3例为乙型肝炎小三阳，1例为乙型肝炎大三阳，1例为乙型肝炎病毒携带者。

二、乙肝病毒表面抗原检测结果

成人组血清乙肝病毒表面抗原均为阴性；新生儿组共有11例（5.5%）阳性，其中2例经16×g高速离心后即转为为阴性，4例经16×g高速离心并且蓝光照射后转为阴性，5例经16×g高速离心和蓝光照射后仍保持阳性（表2）。

表2新生儿组乙肝病毒表面抗原检测为阳性受试者的情况

三、溶血标本乙肝病毒表面抗原检测结果

新生儿组标本中有2例高胆红素的同时为溶血标本（血清血红蛋白浓度为2g/L和3g/L），乙肝病毒表面抗原检测为阴性。在新生儿乙肝病毒表面抗原检测为阴性的血清标本中用随机数字表法选取30例，经人工吹打红细胞后造成溶血标本，经再次×g离心后上机检测血清血红蛋白浓度，分别为1g/L3例、2g/L9例、3g/L14例、4g/L4例。所有标本经再次乙肝病毒表面抗原检测均为阴性。

四、乙肝病毒表面抗原检测为阳性的患儿及其母亲资料

11例乙肝病毒表面抗原检测为阳性的患儿，其中9例接种了乙肝病毒疫苗，另外2例（表2中的2号和6号）患儿接种疫苗情况不详。11例患儿的血清乙肝病毒DNA载量检测均IU/ml。11例中有10例患儿的母亲既往身体健康，只有第11号患儿的母亲为乙肝患者，表现为小三阳。表2中第5和第8号患儿分别在检测阳性7d和10d后复查乙肝病毒表面抗原转为阴性。

新生儿高胆红素血症（neonatalhyperbilirubinemia，NHB）是新生儿中最为常见的临床疾病之一，该疾病发病率占据新生儿住院疾病谱的第1位，可达30%~50%。少数患儿因为胆红素的毒性甚至发展为重症高胆红素脑病，损害患儿的视觉、听觉等神经系统，导致相关功能残疾[3,4]。往往这些患儿在换血治疗或使用血制品前后都会检测乙肝五项，其中乙肝病毒表面抗原检测时常表现为阳性，给报告单的解读和下一步临床工作带来困扰。本研究针对新生儿高胆红素血症标本血清乙肝病毒表面抗原化学发光法检测结果为阳性的真伪问题进行了研究，并对可能造成假阳性的原因及消除方法进行了探讨。

新生儿高胆红素血症以未结合胆红素增高为主，其诊断的金标准是血清总胆红素水平（TSB）。新生儿出生后的胆红素水平是一个动态变化的过程，在诊断高胆红素血症时需考虑其胎龄、日龄和是否存在高危因素。根据年颁布的新生儿高胆红素血症诊断和治疗专家共识[2]，当胆红素水平超过新生儿小时胆红素列线图的95百分位时定义为高胆红素血症。我们参考了该列线图新生儿出生后1~3d95百分位的总胆红素水平（8~16mg/dl），结合工作中碰到的乙肝病毒表面抗原阳性新生儿血清的总胆红素水平基本在μmol/L（约12mg/dl））以上，将本研究的标本入选标准定在血清总胆红素水平大于μmol/L。

我们在工作中遇到的新生儿高胆红素血症乙肝病毒表面抗原检测阳性问题，分析其可能成因有两种：（1）实验干扰，假阳性；（2）临床疾病相关，真阳性。首先需要排除实验干扰造成的假阳性。本研究采用化学发光法检测，该方法临床上最常见的干扰因素为标本凝集不充分或离心不足够，导致血清中残留纤维蛋白原或小的红细胞碎片等物质，结合在包被有抗体的顺磁微粒上，最后呈现为假阳性的结果[5,6,7]。这种假阳性可以通过提高离心转速、增加离心时间来消除。本研究对于乙肝病毒表面抗原检测初次呈阳性的标本，经过16×g、10min高速离心处理后，有2例变为阴性，证实存在这种血清中微小颗粒物质干扰测定的现象。

另一大干扰因素就是溶血。新生儿由于标本采集难度大、采集过程不顺利往往使送检标本呈现一个溶血状态。查阅试剂说明书，显示标本中血红蛋白浓度低于5g/L时对测定没有影响。我们的新生儿组标本中有2例溶血标本，乙肝病毒表面抗原检测为阴性，溶血对检测未造成影响。为了证实说明书中关于溶血不影响测定的结论，我们将30例新生儿标本人为制造成溶血标本，血红蛋白浓度在1~4g/L之间，复测乙肝病毒表面抗原，结果保持阴性，没有变化，证实溶血的确对乙肝病毒表面抗原化学发光法检测不存在干扰。

排除了离心和溶血的干扰，仍然有9例新生儿样本呈现阳性，我们将







































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