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关于发布乙型肝炎病毒基因分型检测试剂技术

文章来源：乙型病毒性肝炎发布时间:2016-11-21 9:45:22 点击数：次

　　国家食品药品监督管理总局关于发布乙型肝炎病毒基因分型检测试剂技术审查指导原则的通告（年第32号）年07月15日发布　　为加强医疗器械产品注册工作的监督和指导，进一步提高注册审查质量，国家食品药品监督管理总局组织制定了《乙型肝炎病毒基因分型检测试剂技术审查指导原则》（见附件），现予发布。

　　特此通告。

　　附件：乙型肝炎病毒基因分型检测试剂技术审查指导原则

食品药品监管总局年7月15日

附件

乙型肝炎病毒基因分型检测试剂

技术审查指导原则

本指导原则旨在指导注册申请人对乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）基因分型检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。

本指导原则是对乙型肝炎病毒基因分型定性检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围

我国年乙型肝炎流行病学调查表明，我国1—59岁一般人群乙型肝炎表面抗原（HepatitisBsurfaceantigen，HBsAg）携带率为7.18%，5岁以下儿童的HBsAg仅为0.96%。据此推算，我国现有的慢性HBV感染者约万人，其中慢性乙型肝炎患者约万例；由于不同的乙型肝炎病毒基因型对现有药物治疗可能存在不同的治疗响应，乙型肝炎病毒分型基因检测在慢性乙型肝炎患者治疗中的作用正被越来越多人所　　精密度的评价方法并无统一的标准可依，可根据不同产品特征或企业的研究习惯进行，前提是必须保证研究的科学合理性。具体实验方法可以参考相关的国外或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求：

4.1用于精密度评价的样本浓度水平应至少包含阴性、弱阳性和强阳性三个水平。

4.2合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。

5.基因混合型的研究

该部分研究主要包括两个目的：一是申报试剂检测不同浓度混合型的能力。申请人应设置不同浓度比例的混合型进行验证。二是申报试剂在判读结果时，是否能够有效区分基因重组型和基因混合型。申请人应设置不同浓度的基因重组型与不同混合比例的基因混合型进行验证。

因理想的不同浓度比例基因混合型样本在临床单位中难以收集，申请人可以使用临床模拟样本进行验证。该部分样本建议用核酸测序明确样本中包含的所有基因型序列，同时应使用核酸定量的方法确定不同基因型的浓度。

如申报产品的结果判读无法有效区分基因混合型与基因重组型，应在产品说明书中进行注明。

6.HBV核酸分离纯化

病毒DNA提取主要有以下目的：富集目的基因浓度、保证目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是决定PCR成败的重要因素之一。企业应对核酸提取的环节做详细的验证。

（五）阳性判断值或参考区间确定资料

阳性判断值确定资料主要指对核酸检测的Ct值进行确认，建议申请人对申报产品用于结果判断的临界值予以确认。参考值范围研究资料样本来源应考虑不同年龄、型别、地域等因素，尽可能考虑样本来源的多样性、代表性。如存在参考值灰区，应提供灰区的确认资料。如采用其他方法对阳性判断值进行确认研究，应说明这种方法的合理性。对于此类试剂，正常人群及其他患病人群中一般不应检出HBV基因型。

（六）稳定性研究资料

稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少3批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

应对样本稳定性进行研究，主要包括室温保存、冷藏和冷冻条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内选择温度点（温度范围），每间隔一定的时间段即对储存样本进行全性能的分析验证，从而确认不同类型样本的效期稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。

试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果应在说明书和项中进行详细说明。

（七）临床试验

1.试验方法

乙型肝炎病毒基因分型核酸检测试剂目前主要供临床医护人员对慢性乙型肝炎患者设置临床治疗方案提供参考依据。随着乙型肝炎基因型与肝炎病情关系的研究工作不断深入，研究方法不断改进，新的研究成果可能将被转化应用于临床工作中。如乙型肝炎病毒基因分型核酸检测试剂用于新的临床用途，应根据新的临床用途特点设置具有针对性的临床试验研究方案。

参比方法的选择可以考虑以下几方面：

1.1如已有同类产品上市，可以选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参比试剂，采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。应充分考虑已上市同类试剂的型别选择、靶序列选择、分析灵敏度等特性，确保考核试剂与申报试剂具有明确可比性。

1.2申请人亦可采用核酸序列测定方法作为此类试剂临床试验研究的参比方法，验证考核试剂检测结果与核酸序列测定（测序）结果之间的一致性情况。临床试验报告中应对选用的测序方法做详细介绍。

申请人应提供以下关于测序部分的详细试验资料，需有临床试验单位签章确认：

1.2.1测序方法原理、测序仪型号、测序试剂及消耗品的相关信息。

1.2.2测序方法所用引物相关信息，如基因区段选择，分子量、纯度、功能性实验等资料。引物设计应合理涵盖考核试剂扩增的靶核酸区段、位点、及所有突变类型。

1.2.3对所选测序方法的分析性能进行合理验证，尤其是最低检测限的确认，建议将所选测序方法与申报试剂的相关性能进行适当比对分析。

1.2.4测序方法应建立合理的阳性质控品和阴性质控品对临床样本的检测结果进行质量控制。

1.2.5提交有代表性的样本测序图谱及结果分析资料。

2.临床试验机构的选择

临床试验机构应获得国家食品药品监督管理总局资质认可。建议申请人在选择临床试验机构时，应考虑试验机构之间的地域代表性，临床试验机构应具有分子生物学方法检测的优势，实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，考核试剂和对比试剂都应处于有效的质量控制下，最大限度保证实验数据的准确性及可重复性。

3.临床试验方案

临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的方案。各临床试验机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉试验进程，尤其是数据收集过程。

试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床试验都应记录在案，并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各临床试验机构选用的对比试剂应一致，以便进行合理的统计学分析，同时方案中应明确写明对于对比试验研究中测定结果不符的样本进行确认试验的第三方试剂或方法。

4.临床试验对象选择

4.1基因型方面的考虑

HBV病毒为DNA病毒，其基因具有显著的多样性，不同的地区和民族，HBV流行的基因型不同。境内流行的HBV基因型主要为B型、C型，部分地区存在少数D型，以及重组型基因B/C型，B/D型，C/D型等。而且，HBV基因型具有一定的地域差异，不同地区流行的HBV基因型也不尽相同。因此，在选择HBV感染者病例时，首先应根据HBV流行的情况，选择能代表我国不同地区流行基因型的HBV感染者病例，以对试剂检测我国流行的HBV病毒的能力进行客观科学的评价，选择的基因型应包括上述三种主要的基因型。

4.2病例选择及样本类型

应涵盖注册申报试剂所声称的所有基因型，应选择部分干扰样本（交叉反应样本），比较干扰组和病例组结果，以便对申报产品的临床性能做出科学的分析。临床试验所需样本总例数不少于例，其干扰组例数的选择以不超过总临床样本数的10%为宜。对于B型及C型基因型临床样本，应满足每种基因型不少于例临床样本；对于D型基因型及其他基因型临床样本，建议每种不少于30例阳性病例。每种基因型临床样本应来源于乙型肝炎病毒核酸检测阳性的患者。如注册申报试剂中包含其他基因型，应结合这部分基因型在我国的流行病学特点，临床应用情况等综合因素，对其临床有效性进行科学评估。

在样本选择时，应注重患者来源的不同地域性，不同病情进展，不同药物治疗方案等。对于干扰组样本的选择，应考虑到在检测过程中容易产生干扰，可能造成假阳性/假阴性的情况，以从临床角度考察其分析特异性。

5.统计学分析

对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如检测结果一致性分析、不同基因型阴性/阳性符合率等。对于本类产品对比试验的等效性研究，常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表χ2检验或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性，统计分析应可以证明两种方法的检测结果有无明显统计学差异。在临床试验方案中应明确统计检验假设，即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。

6.结果差异样本的验证

在数据收集过程中，对于两种试剂的检测结果有不一致的样本，如有必要，应采用临床上公认较好的第三种同类试剂或参考方法对结果进行确认，同时结合患者的临床病情对差异原因及可

能结果进行分析。

7.临床试验总结报告撰写

根据《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告年第16号）的要求，临床试验总结报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述：

7.1临床试验总体设计及方案描述

7.1.1临床试验的整体管理情况、临床试验机构选择、临床试验主要研究人员简介等基本情况介绍；

7.1.2病例纳入/排除标准、不同年龄段人群的预期选择例数及标准；

7.1.3样本类型，样本的收集、处理及保存等；

7.1.4统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。

7.2临床试验具体情况

7.2.1临床试验所用产品的名称、批号、有效期及所用机型等信息，以及对比试验产品的注册情况；

7.2.2对各临床试验机构的病例数、年龄分布情况进行综合分析，建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比；

7.2.3质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、质控品运行情况，对检测精密度、质控品测量值的抽查结果评估；

7.2.4具体试验过程，样本检测、数据收集、样本长期保存、结果不一致样本的校验等。

7.3统计学分析

7.3.1数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改；

7.3.2阳性符合率、阴性符合率、总体符合率；

7.3.3以交叉多格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行多格表χ2检验或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性。应明确将每种基因型单独进行统计。

7.4讨论和结论

对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床试验有无特别说明，最后得出临床试验结论。

（八）产品技术要求

拟定产品技术要求应符合《办法》和《体外诊断试剂注册申报资料要求及说明》的相关规定。申请人应当在原材料质量和生产工艺稳定的前提下,根据申请人产品研制、前期临床评价等结果,依据国家标准、行业标准及有关文献，按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告年第9号）的有关要求编写。内容主要包含产品性能指标和检验方法。第三类产品技术要求中还应当以附录形式明确主要原材料、生产工艺及半成品要求。

附录中应将待测靶基因的基因位点、引物/探针设计及来源、参考品设置、来源及验证情况、各种酶的来源、特性及验证等重点内容予以明确。

乙型肝炎病毒基因分型检测试剂的产品技术要求应主要包括以下性能指标：物理性状、阴/阳性参考品符合率、精密度、最低检测限等。阳性参考品主要考察对试剂盒覆盖范围内不同基因的检测符合性，阴性参考品则重点对申报试剂的分析特异性进行验证。

（九）注册检验

根据《办法》要求，首次申请注册的第三类产品应该在国家食品药品监督管理总局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检验机构进行连续3个生产批次样品的注册检验。对于已经有国家标准品的检测项目，在注册检验时应采用相应的国家标准品进行检验；对于目前尚无国家标准品的项目，生产企业应建立自己的参考品体系并提供相应的内部参考品。

（十）产品说明书

说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、实验方法、检验结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告年第17号）的要求。境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译应准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。

结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，明确乙

型肝炎病毒（HBV）基因分型检测试剂说明书的重点内容，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。

应至少包括以下内容：

1.1试剂盒用于体外定性检测已明确为乙型肝炎病毒核酸阳性患者的血清、血浆等样本中乙型肝炎病毒基因型。辅助医疗专业人员了解病人的乙型肝炎病毒基因型感染情况以及确定适当的治疗方法。

1.2乙型肝炎病毒基因分型试剂的基因型应至少包括B型、C型、D型，如果申请人略去上述任意一种推荐的基因型，应给出合理的解释。

1.3适用人群：确诊的慢性乙型肝炎病毒感染者。

1.4简要介绍乙型肝炎病毒基因型的特征，包括不同基因型的特征、不同基因型常见亚型、不同基因型在地域及人群中的分布情况、不同基因型在临床的应用特点。

1.5强调该试剂盒检测结果仅供临床参考，不应作为治疗药物调整的唯一依据，临床医生应结合患者病情及其他实验室检测指标等因素对患者治疗进行综合判断。

2.1对试剂盒检测能够覆盖的所有被检测的基因型进行详细描述（靶序列长度及来源区段、基因型类型及相关特征等），对引物及探针设计简介、不同样品反应管组合、对照品设置及荧光信号检测原理等进行逐项介绍。

2.2核酸提取纯化的方法、原理等。

2.3试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。如反应体系中添加了相关的防污染组分（如UNG酶），也应对其作用机理作适当介绍。

3.1详细说明试剂盒内各组分的名称、数量、比例或浓度、稳定性等信息，阴性/阳性对照品（或质控品）可能含有生物源性物质的组分，应说明其生物学来源、活性及其他特性；说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。