学术动态15丨乙型肝炎病毒前核心蛋白p

摘要

病毒蛋白对乙型肝炎病毒(HBV)感染宿主免疫防御的拮抗作用是导致HBV持续存在和慢性肝炎发展的重要原因。在临床实践中，HBeAg阳性（大三阳）慢乙肝患者对干扰素-α（IFN-α）的应答较HBeAg阴性（小三阳）慢乙肝患者差。乙型肝炎e抗原(HBeAg，p17)可调控宿主免疫反应，以协助建立持续性病毒感染。然而，胞内形式的HBeAg（前C蛋白中间体p22）的功能仍然难以捉摸。在这项合作研究中，郭海涛教授团队和张继明教授团队共同探究发现，在IFN-α刺激下，胞内前C蛋白中间体p22蛋白能够显著降低干扰素刺激反应元件(ISRE)的活性和下游干扰素刺激基因(ISGs)的表达。与此相一致，HBeAg阳性患者在接受IFN-α治疗后肝脏中ISGs的诱导表达弱于HBeAg阴性患者。机制上，虽然p22不改变IFN-α处理的细胞中总STAT1或pSTAT1的水平，但它通过与核转位因子粘附素α1的C-末端富含精氨酸的结构域相互作用，阻止了pSTAT1的入核转位。综上所述，p22蛋白阻碍了JAK-STAT信号转导，帮助病毒逃避宿主的先天免疫反应，从而拮抗慢乙肝患者的IFN治疗。

01丨HBV前C蛋白在细胞培养中以p22形式存在

如图1A所示，HBeAg的生物合成由前C蛋白（precore）在细胞内的多步骤加工完成，先前的一项研究已经鉴定出一个22kDa的p22前C蛋白中间体，它含有完整的C-末端结构域(CTD)，但缺乏N-末端信号肽。如图1B所示,为了进一步验证p22在HBV复制和HBeAg生产过程中的存在，将表达全部HBV蛋白的pHBV1.3质粒转染HepG2细胞。通过蛋白免疫印迹实验（Westernblotting）用抗CTD抗体检测胞内核心蛋白(p21)和p22的表达。通过转染core缺失的pHBV1.3ΔC质粒、仅表达core的pHBc质粒和仅表达precore的pcHBe质粒，进一步证实了来自pHBV1.3的核心蛋白(p21)和p22的表达。通过缺少19个氨基酸编码序列的precore的表达证实了p22中间体的蛋白质大小。转染pcHA-HBe质粒产生了24kDa的细胞内N端血凝素(HA)标记的前C蛋白(HA-p22)，而胞内没有检测到分泌的HA-HBeAg，这与以前的研究一致，即HBeAg在Furin切割后迅速从高尔基体分泌出来，而不保留在高尔基体中。结果表明，细胞内的HBVprecore主要以p22形式存在。

图1HBV前C蛋白在细胞内以p22形式存在。

(A)HBV前C和核心蛋白翻译示意图。HBV核心蛋白是由前基因组RNA(pgRNA)形成的，前C区(p25)的ORF由前C区mRNA翻译而来，经信号肽酶(Spase)去除N端信号肽(SP)后加工成p22，p22在C端区(CTD)进一步加工形成分泌型HBeAg(P17)。(B)向HepG2细胞转染pHBV1.3、pHBV1.3ΔC、pcHBc、pcHBe、pcHBeΔSP和pcHA-HBe质粒。转染后第5天收集细胞，用抗CTD或HA标签的抗体进行Westernblotting分析。

02丨p22不形成衣壳，也不支持DNA复制

如图1A所示，除了p22蛋白N末端延伸的10个氨基酸外，HBV核心抗原蛋白和p22具有完全相同的氨基酸序列。在本研究中，作者评估了全precore/p22在哺乳动物细胞中形成衣壳的能力。如图2A中的结果所示，与转染pHBV1.3质粒相比，转染不表达core的pHBV1.3ΔC质粒尽管表达p22，但由于衣壳形成缺陷而不能支持HBV前体RNA(pgRNA)的包裹和DNA复制。pHBV1.3ΔC的病毒复制是通过反式互补core补救的，而不是p22或HA-p22。此外，带有C-7q突变的p22在衣壳形成方面仍然存在缺陷(图2B)。因此，与core不同，p22不能形成衣壳。上述结果提示，p22的N端10个氨基酸构成的结构域负性调节衣壳组装，p22对于HBVDNA复制本身不起重要作用

图2preC/p22不能支持HBV衣壳的形成和DNA复制。

(A)用pHBV1.3+对照载体、pHBV1.3ΔC+对照载体或pcHBc、pcHBe或pcHA-HBe共转染12孔板中的HepG2细胞，第5天收集细胞，Northernblotting分析病毒总RNA和包囊化pgRNA，Southernblotting检测核心DNA，天然衣壳凝胶EIA分析细胞质衣壳。用抗CTD结构域的核心抗体进行Westernblotting检测核心蛋白和前C蛋白的表达，用抗HA抗体进行Westernblotting检测HA标记的p22蛋白的表达。(B)将pHBV1.3+对照载体、pHBV1.3ΔC+对照载体、pcHBeC-7q共转染12孔板中的HepG2细胞5天。病毒RNA、DNA和蛋白质的分析以与A组相同的方式进行。

03丨p22的亚细胞定位

作者使用组成性表达HA标记的p22(HA-p22)和HBeAg(HA-HBeAg)的HepHBe4细胞株和以共价闭合环状DNA(cccDNA)依赖方式表达HA-p22和HA-HBeAg的四环素诱导型HepBHAe82细胞株，检测p22在不同细胞间的分布。免疫荧光结果显示，HA-p22主要存在于细胞质中，但它也能够移位到细胞核(图3A)。通过转染HA-p22表达质粒的HepG2细胞的亚细胞分离进一步证实了这一点，这表明p22既存在于细胞质中，也存在于细胞核中(图3B)。由于p22在内质网进行翻译，并被认为通过内质网相关的降解途径部分逆转到胞浆中，如图3C所示，对转染HA-p22的细胞进行了微粒体分离，发现p22既存在于微粒体中，也存在于细胞质中。此外，当用弗林蛋白酶（furin）抑制剂处理细胞以阻断furin介导的p22的切割和随后的从高尔基体释放HBeAg时，可以看到p22在微粒体中显著积聚，而胞质不增加。这表明，一旦p22到达高尔基体，它就不能再被运回细胞质。p22进入高尔基体和内质网到胞浆反转位的机制有待进一步研究。

图3p22的亚细胞定位。

(A)HepHA-HBe4细胞和四环素未诱导(Tet-)、四环素诱导(Tet+)HepBHAe82细胞，免疫荧光显微镜下观察HA-p22(红色)染色。细胞核用DAPI(蓝色)染色。(B)12孔板中的HepG2细胞转染对照载体或pcHA-HBe(HA-p22)。转染后第5天收集细胞，用抗HA抗体进行亚细胞分级，检测胞浆和胞核裂解产物中HA-p22的表达。(C)将HA-p22转染12孔板中的T细胞，不加处理或用furin抑制剂处理。转染后第5天收集细胞，进行微粒体分离分析。用抗HA抗体进行Westernblotting检测膜相关HA-p22和胞浆HA-p22。

04丨p22抑制ISRE启动子活性和ISGs表达

本研究收集了11例HBeAg阳性患者和10例HBeAg阴性患者在基线状态和IFN治疗24周后的两次肝活检标本用于转录组测序(RNA-seq)分析。如图4所示，在干扰素治疗结束时，HBeAg阳性患者诱导表达的ISG总体上弱于HBeAg阴性患者。结果表明，循环中的HBeAg或胞内的p22可能对IFN信号通路有负性影响。

图4IFN-α诱导HBeAg阳性和HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝内ISG丰度

为了研究p22和HBeAg对ISRE活性的影响，作者将ISG56启动子控制荧光素酶报告质粒(ISG56-Luc)与对照载体或不同的HBV蛋白表达质粒共转染HepG2细胞，随后IFN-α刺激。如图5A所示，对照组在IFN-α刺激后表现出较高的ISG56启动子活性，而core或p22的表达显著降低其活性，证实p22或其胞外产物HBeAg对IFN信号通路有抑制作用。当其他HBV蛋白共表达时，没有发现这种影响，这表明对ISG56启动子活性的抑制是core或p22所特有的。为了进一步确定这种抑制是由细胞内p22还是细胞外HBeAg介导的，用重组HBeAg或furin抑制剂1处理ISG56-Luc细胞，结果表明，重组HBeAg处理的细胞没有表现出对IFN-α的抑制作用。用阻止HBeAg分泌的furin抑制剂处理的细胞没有表现出p22介导的ISG56启动子活性降低的减弱，这表明是细胞内的p22而不是分泌型HBeAg阻断了IFN-α信号通路。

图5ISG56启动子控制荧光素酶（ISG56-Luc）报告实验结果

此外，定量PCR检测ISG56和MxA的相对表达量，发现HBVcore或p22明显抑制IFN-α诱导的ISG表达。进一步证实了其对IFN诱导的ISG产生的抑制作用。

05丨p22在体外可抑制HBV感染系统中ISG的产生

为了在更具生理性的环境中验证p22的上述作用，作者制备了两种p22缺失病毒，一种含有前C区的AT起始密码子突变，另一种含有前C区GA终止密码子突变，并建立HepG2-NTCP12细胞感染模型。用IFN-α处理感染细胞，定量PCR(qPCR)的结果表明，与感染野生型病毒的细胞相比，感染p22缺失HBV的细胞中诱导ISG表达的作用更强。利用HBV感染系统的上述结果进一步验证了p22对IFN-α的抑制作用，并排除了观察到的效应是蛋白质过度表达的可能性。

06丨p22通过竞争pSTAT1/2与核粘附素的相互作用来抑制pSTAT1/2的核转位

众所周知，IFN-α通过典型的JAK-STAT途径诱导ISG的产生，导致磷酸化的STAT1/2异二聚体在ISGF3复合物中的核移位，并与含有ISRE元件的ISG启动子结合启动ISGs的表达(图6A)。为了阐明p22介导的抑制IFN信号转导的机制，作者研究了p22对IFN-α信号转导途径中STAT磷酸化的影响。如图6B所示，在p22存在的情况下，IFN-α刺激的HepG2细胞全细胞裂解物中pSTAT1和pSTAT2的水平与对照组相比没有变化，表明IFN与其受体有适当的结合和STAT1/2的磷酸化。然而，亚细胞分组分析显示，p22导致pSTAT1和pSTAT2在胞浆中积累，相应地降低了细胞核中pSTAT1/2的水平，表明p22阻止了pSTAT1/2复合体的核转位(图6C)。有趣的是，core并没有阻止pSTAT1或pSTAT2的核转位(图6D)，这表明core对IFN信号通路的抑制方式不同，这有待进一步研究。

图6p22阻断STAT1/2的核转位。

(A)IFN-α诱导的JAK-STAT信号和ISG表达激活示意图。(B)将对照载体或pcHBe(P22)转染12孔板中的HepG2细胞5天，不处理转染细胞或用IFN-α处理。Westernblot检测总STAT1、pSTAT1和pSTAT2水平。(C)将对照载体或p22转染6孔板中的HepG2细胞5天，不处理转染细胞或用IFN-α处理。收集的细胞进行细胞分离，检测胞浆(顶部)和细胞核(底部)中pSTATs的水平。(D)用对照载体或core/p21转染6孔板中的HepG2细胞5天，不处理细胞或用IFN-α处理。细胞分离检测的pSTAT1/2水平。

ISGF3复合体需要与核转运蛋白karyopherinα1(Kα1)相互作用才能进入细胞核并激活ISG表达。为了进一步研究p22介导的阻断ISGF3复合体核转位的机制，作者通过免疫共沉淀实验证实了p22与Kα1相互作用的能力，进一步实验显示在p22存在的情况下，Kα1与pSTAT1的结合量减少(图7)。因此，作者得出结论，p22与pSTAT1竞争结合核转运蛋白Kα1，从而阻止pSTAT1进入细胞核。

图7p22与pSTAT1竞争结合核转运蛋白Kα1

07丨p22通过其CTD阻断IFN-α信号

HBV核心蛋白在其富含精氨酸的C-末端结构域(CTD)上具有两段核定位信号，p22与核心蛋白有相同的C末端。作者构建了HA-p22的CTD缺失突变体(HA-p22ΔCTD)，该突变体显示其不能从细胞质移位到细胞核(图8A)。免疫共沉淀实验表明，当HA-p22与Kα1相互作用时，HA-p22ΔCTD突变体不再与Kα1共沉淀，这表明p22的CTD在其与核转运蛋白相互作用和p22的核转位中发挥作用(图8B)。此外，ISG56-LUC报告分析表明，(HA-p22ΔCTD失去了抑制IFN-α诱导的ISG56启动子活性的作用(图8C)。由此推测，p22的CTD区在抑制IFN诱导的JAK-STAT信号中发挥着重要作用。

图8CTD结构域是p22抑制干扰素信号所必需的。

(A)将表达HA-p22或HA-p22Δ的质粒转染6孔板中的HepG2细胞5d，进行细胞分裂分析。用抗HA抗体的Westernblot检测全长和CTD截短型HA-p22在全细胞和亚细胞组分中的存在。(B)将FLAG-Kα1表达质粒与HA-p22或HA-p22ΔCTD表达质粒或对照载体共转染T细胞5天。转染细胞裂解后与抗HA抗体进行免疫共沉淀，用抗FLAG抗体进行Westernblot检测共沉淀的FLAG-Kα1。(C)将ISG56-Luc与对照载体p22、HA-p22、HA-p22ΔCTD共转染96孔板中的HepG2细胞5天后，不处理细胞或用IFN-α处理，收集细胞进行双荧光素酶活性测定。

总结

综上所述，本研究进一步解释了胞内HBVprecore在病毒发病机制中的生物学功能。尽管precore或HBeAg对HBV感染不是绝对必需的，但越来越多的证据表明，p22拮抗先天免疫反应，precore在维持HBV持续感染中发挥了重要的免疫调节作用。因此，precore或HBeAg有望成为慢乙肝药物治疗的新靶点，或者至少在提高基于IFN的免疫调节治疗的有效性方面是有希望的。

图9p22介导的IFN-α信号抑制模型

文献来源：

MitraB,WangJ,KimES,etal.HepatitisBVirusPrecoreProteinp22InhibitsAlphaInterferonSignalingbyBlockingSTATNuclearTranslocation.JVirol.;93(13):e-19.PublishedJun14.doi:10./JVI.-19

文字：张鹏

排版：李德瑶

校对：高林

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