cccDNA慢性乙肝持续感染的元凶

慢性乙型病毒性肝炎影响着全球超过2.5亿人口，每年约有65万人死于HBV相关终末期肝病。共价闭合环状（ccc）DNA是慢性乙肝持续感染的元凶，作为病毒复制的中介，其在宿主肝细胞核内以微染色体的形式存在，目前的治疗手段难以将其彻底清除，从而达到慢性乙肝的彻底治愈。

Gut杂志上发表医院Nassal教授的一篇综述，该文概述了cccDNA的研究历史、目前研究中存在的困难、近期的研究进展以及与之相关的治疗策略。

人HBV是嗜肝DNA病毒的原型，同属哺乳动物的正嗜肝DNA病毒还有旱獭肝炎病毒（WHV）、地松鼠肝炎病毒（GSHV）、毛猴乙型肝炎病毒（WMHBV）等，此外还有水禽类嗜肝DNA病毒，如鸭乙型肝炎病毒（DHBV）、鹭乙型肝炎病毒（HHBV）。

01

HBV的结构特征

如图1A所示，HBV病毒，或称「Dane颗粒」，由含有3种外膜蛋白（血清学上的HBsAg）的包膜包裹核衣壳（血清学上的HBcAg）构成。核衣壳内包含的病毒基因组是一个部分双链的松弛环状DNA，即RC-DNA。HBV基因组最显著的特征在于其结构紧密，功能齐全（图1B）。HBV基因组的开放阅读框（ORF）存在重合，一个ORF可转录2种mRNA，编码2种蛋白，所有基因表达和复制所必须的调节原件都埋在基因序列中。

图1.HBV的基本分子特征。图A为病毒结构；图B为基因构成（绿色箭头：启动子；EnHⅠ/EnH‖：转录增强子；DR1，DR2：直接重复序列；红色波浪线：正链DNA上的RNA引物）

02

HBV的感染与复制

如图2所示，HBV感染肝细胞始于病毒颗粒表面L蛋白被肝细胞表面钠-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）受体识别并结合，可能以内吞形式进入细胞。在胞浆中释放出核衣壳，核衣壳在核心蛋白核定位信号的作用下，进入胞核，并释放出RC-DNA，并最终形成cccDNA。cccDNA与核小体结合形成独立于细胞染色体外的微小染色体结构，这一过程有赖于HBx和核心蛋白的参与。cccDNA是病毒转录的模板，其利用宿主细胞的RNA聚合酶进行转录，可产生3种亚基因组RNA，用于合成病毒蛋白，以及2种长于基因组的RNA，用于病毒复制、转译核壳等。有效的cccDNA转录受到肝脏特异性转录因子及HBx的调控。在细胞浆中，pgRNA和病毒P蛋白一起被新形成的核壳蛋白包裹，在此以pgRNA为模板，逆转录形成负链，随后pgRNA降解，正链合成，新的RC-DNA形成。含有RC-DNA的成熟核心颗粒包裹外膜蛋白，在细胞多泡体的参与下分泌出细胞，此外，新生的成熟核心颗粒还可以再次入核，扩充细胞的cccDNA池。

图2.肝细胞中HBV的生命周期（GVG：粘多糖；NTCP：钠-牛磺胆酸共转运多肽）

01

宿主特异性的限制

由上述HBV感染的生命周期可见，cccDNA是HBV在肝内进行复制的模板，是建立有效感染的基础。然而，由于HBV的宿主范围极窄，目前仅有少量、复杂的体外感染系统可用于研究cccDNA。使用相应宿主的原代肝细胞是解决这一难题的策略之一，但人的肝细胞获得困难，替代动物树鼩饲养要求高，价格昂贵。此外原代肝细胞存在最主要的问题在于伴随着NTCP表达的逐渐缺失，其对HBV的易感性也很快下降。长期HBV易感性可通过向免疫缺陷小鼠移植人或者树鼩的肝细胞实现，但技术非常复杂。

02

NTCP受体发现带来的希望

NTCP作为HBV受体这一发现为cccDNA的研究提供了极大便利，通过表达NTCP受体，实验中常用的HepG2、Hu7等细胞系均可被HBV感染，但要获得高感染率仍需在培养体系中加入相当高剂量的病毒颗粒（细胞数量的10E4倍）来实现。

03

非感染模型难以形成cccDNA

研究HBV的非感染模型，向细胞转染HBV质粒或尾静脉高压注射HBV质粒等，cccDNA形成均很少甚至没有。在这些模型中，质粒替代cccDNA成为病毒复制的主要模板。与之类似的还有HBV转基因小鼠，其HBV基因是整合在小鼠基因组中的。

04

鸭肝病毒模型对cccDNA的研究贡献

不同于HBV，DHBV在不同的体系中很容易检测到cccDNA，而鸭肝细胞也相对容易获得，体内试验较为便利。鸭肝病毒模型阐明了cccDNA在肝炎病毒复制周期和持续感染中的重要作用，主要研究结果包括：cccDNA的形成有赖于逆转录，而非DNA的半保留复制；cccDNA在细胞核内以cccDNA池的形式存在，每个细胞核中往往不止1个拷贝；检测单个细胞核内cccDNA的技术。近期有研究利用携带一种包膜缺陷DHBV病毒的肝细胞系，如DStet5，包膜蛋白缺陷导致病毒分泌受阻，因此可诱导单个细胞内cccDNA水平大幅增加（如图3），这种DHBV在人的肝癌细胞系内也可达到很高的cccDNA水平，从而为cccDNA的研究提供了便利。

01

Southernblot检测敏感性有限

由于cccDNA呈超螺旋结构，相比与同等长度的RC-DNA，其具有更高的电泳迁移率，因此cccDNA可通过Southernblot与其他形式的肝病毒基因组进行鉴别。

图3.Southernblot检测cccDNA

慢性感染鸭肝炎模型显示单个细胞内平均含有10拷贝左右的cccDNA，不同细胞间拷贝数变化很大，且随着感染的病程具有时间上的波动。人慢乙肝单个肝细胞拷贝数似乎更低（平均0.1-1拷贝/细胞），而Southernblot检测下限约为10拷贝/细胞，因此如此低的cccDNA水平使得Southernblot难以准确的检测到单个细胞的拷贝数。

02

其他检测方法难以排除RC-DNA的干扰

所有基于PCR的检测方法，如引物设计在RC-DNA正链缺失段两端的「over-gap」PCR，或以环状DNA为模板的滚环扩增，但不能绝对排除RC-DNA的干扰。另有非PCR的侵入分析技术，利用一条引物与cccDNA形成3链结构，这一结构可被特异性的核酸内切酶识别。总之，最大化cccDNA的选择性，排除RC-DNA干扰是准确定量cccDNA的关键，只对胞核而非全细胞进行检测，并联合外源性核酸酶特异性降解RC-DNA或为一种解决策略。另外应注意单链上的一个缺口即可造成双链解螺旋，导致低估cccDNA载量。对研究者而言，应当清楚每一种方法的缺陷，并亟需建立一种标准的高敏感性的检测方法。对读者而言，应清楚的认识到，对于已经处于很低水平的HBVcccDNA，宣称进一步降低其载量的数据支持或并不充分。

01

宿主DNA修复系统参与cccDNA的从头合成

侵入肝细胞的RC-DNA是cccDNA形成的直接前体，由RC-DNA形成cccDNA称为「从头合成」，这一过程需要去除负链5』端的末端P蛋白和3』端的末端过剩段（r），两端连接成环，同时正链的5』端去除RNA引物，3』进行延长，两端闭合。在cccDNA从头合成过程中，病毒P蛋白有部分参与，但宿主DNA修复系统在其中发挥了重要作用，主要参与的酶有核酸内切酶、酪氨酰磷酸二酯酶、DNA聚合酶、多核苷酸激酶或磷酸酶、DNA连接酶等（如图4）。

图4.RC-DNA的结构特征

02

cccDNA的确切生命周期尚不清楚

核苷类药物停药或免疫抑制状态下病毒反弹提示cccDNA可持续存在长达数十年，但目前尚没有人类cccDNA消减动力学数据。土拨鼠和鸭肝感染模型提示cccDNA的半衰期为33和57天。黑猩猩急性感染时，cccDNA半衰期缩短至3天，但仍有痕量cccDNA可持续数年。在慢性感染中，新的cccDNA的产生与已存在cccDNA的消失受到众多因素影响，二者的综合结果决定了cccDNA池的大小。当前，我们仍无法确切知道单个cccDNA分子的生命周期。

cccDNA的生命周期取决于单个分子，还是存在cccDNA的更新？如果存在更新，那么是经过何种途径？（细胞内？细胞间？或细胞外？）其动力学特征如何？

在急性自限性HBV感染中，cccDNA是如何被清除的？

如果细胞可以从cccDNA的层面获得免疫学治愈，那其具体机制如何？

cccDNA在细胞分裂过程中是否存活？如何存活？

什么因素限制了cccDNA在大多数人的肝癌细胞系及鼠肝细胞的形成和积累？

为什么这种限制在鸭HBV并不明显，甚至是感染人的细胞？

何种机制限制了cccDNA的无限扩增，这种机制可用于减少cccDNA的拷贝数么？

以cccDNA作为治疗靶点，首先需要阐明cccDNA的生命周期取决于单个分子的生命期还是通过更新维持cccDNA池。若没有cccDNA的更新，那么阻断RC-DNA向cccDNA转变仅在感染之初有效。

01

阻断NTCP受体

在人源化小鼠模型上，低剂量HBV感染后予以NTCP受体阻断剂MyrcludexB治疗，不仅可以阻止病毒播散，还可使已感染细胞RC-DNA向cccDNA的转变过程受损。这一结果上需要在临床研究中加以确认。

02

靶向DNA修复系统

第二个可能的靶点是宿主DNA修复系统。然而，宿主DNA修复系统繁杂庞大，且存在代偿机制，阻断其中某条通络或并不能阻断cccDNA的形成，而大范围阻断将影响到细胞本身的DNA修复。

03

阻断RC-DNA入核

另一个替代策略是阻断RC-DNA前体入核，RC-DNA的核转运依赖于核衣壳，靶向核衣壳的药物正在研发当中。

04

诱导核衣壳在胞浆分解

诱导组装空的核衣壳或不规则的聚合物，将破坏核衣壳的稳定性，它们或在胞浆中解体，RC-DNA释入胞浆，不仅无法达到胞核，反被胞浆DNA感受器识别，诱导1型干扰素的产生。需要再次强调的是，减少已有的cccDNA，需要以cccDNA池通过更新维持其数量为前提。

05

功能性失活cccDNA

cccDNA的转录受到外部调控，靶向这些细胞调控机制或达到cccDNA功能性失活。这类选择包括干扰素α、靶向HBx的药物，以及DNA损伤结合蛋白DDB1。然而功能性失活cccDNA的局限在于在cccDNA存续期间需要持续干预。此外，转染无转录活性cccDNA的细胞对免疫介导的cccDNA清除更加稳定。因此这一观点需要更多的研究加以证实。

06

直接清除已有cccDNA

肝细胞内cccDNA池的稳态取决于cccDNA消长的速度。由于cccDNA更新动力学尚不明确，清除已有的cccDNA似乎是更加直截了当的选择。在慢性感染条件下，清除已有cccDNA有两种策略，一是免疫介导的cccDNA的清除，二是设计核酸酶对基因进行编辑。

⑴免疫清除

天然免疫和适应性免疫在清除急性HBV感染时发挥重要作用，慢性HBV感染存在免疫应答的不足，重新建立有效的免疫应答意义重大。免疫介导的cccDNA清除包括两个层面：一是从肝细胞内清除cccDNA，即非溶细胞式清除；二是由杀伤性T细胞破坏含有cccDNA的肝细胞。两种机制在急慢性HBV感染时都存在，但各自的相对贡献尚不清楚。近期一项研究提示非常高剂量的干扰素-α，或有效激活淋巴毒素-β受体可直接靶向作用于cccDNA的完整性，经APOBEC3A和B介导负链去氨基作用，并最终降解cccDNA。尽管在某些方面存在争议，Toll样受体7激动剂GS-的临床前试验结果充满希望，肯定了激活天然免疫应答的治疗价值。

⑵基因编辑

在不同免疫介导的cccDNA下降过程中，一部分cccDNA似乎相当顽固，难以进一步降低。这或许是含有cccDNA细胞本身的特质，也有可能是cccDNA存在更难以被分解的形式，例如甲基化、染色体化等。利用核酸酶进行基因编辑的技术进步催生了靶向cccDNA的新工具，例如锌指核酸内切酶、类转录激活效应物核酸内切酶、以及RNA引导的成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)基因组编辑技术。这类新技术仍面临诸多挑战，如不能特异性靶向含有cccDNA的肝细胞，线性病毒DNA整合到肝细胞基因组，以及DNA修复系统可能再次生成完整的cccDNA等。此外，细胞内过量的RC-DNA是否会影响到药物准确靶向cccDNA并不清楚。因此，发展其他新技术，包括治疗性疫苗、反义寡核苷酸和基于RNA干扰等，仍具有广阔的空间。

图5.靶向cccDNA的潜在治疗策略

cccDNA在HBV持续感染中的作用毋庸置疑，治愈慢性乙肝将必须攻克这一难题。目前，受限于体内体外实验模型的局限，对cccDNA的形成、降解等生物学特性的认识仍存在许多空白，随着细胞感染系统和小动物模型的建立，这些问题有望在不远的未来得以解答。彻底消除cccDNA，仅依靠一种策略可能难以实现，联合对cccDNA生化特征的认识、机体在急性感染时免疫系统清除cccDNA的方式以及操纵编辑DNA的新技术，或有望实现这一目标。希望终有一天，慢乙肝可以像慢丙肝一样被治愈。

如果觉得文章不错，请踊跃点赞吧!

您的分享是我们前进最大的动力！

欢迎访问：







































白癜风手术多少钱
北京治疗白癜风较好的医院